厭氧微生物菌種保藏技術

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厭氧微生物菌種保藏技術目前，中國厭氧微生物資源管理中心（China Collection of Anaerobic Microorganisms, CCAM）已保藏各類厭氧和兼性厭氧微生物240屬，601種，915株。其中，厭氧微生物模式菌株530餘個，占已報道厭氧微生物物種的24%；產甲烷古菌模式物種46個，占已知產甲烷菌物種的28%。厭氧微生物模式物種保藏數量居全國首位，全球第四位。

CCAM建立了厭氧微生物高通量篩選、多相系統分類、毛細管低溫保藏和系統基因組學等關鍵技術，先後提出厭氧微生物新目1個，新科6個，是國內報道厭氧微生物新科最多的單位。

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史上最全菌種保藏要求及方法

應針對不同保藏菌株確定適宜的保藏方法：同一菌株應選用兩種或兩種以上方法進行保藏；只能採用一種保藏方法的菌株或細胞株應備份並存放於兩個以上的保藏設備中；菌種保藏方法參照相應的標準操作規程；菌種的入庫和出庫應記錄入檔，實行雙人負責制管理；重要菌種應應異地保存備份；高致病性病原微生物和專利菌種應由國家制定的保藏機構保藏；菌種保藏設施應確保正常運行，設專人負責管理，定期檢修維護；菌種保藏設施應備有備用電源，防止斷電事故發生。

菌種保藏方法

菌種保藏方法多種多樣，有的複雜，有的簡單實用。保藏效果也不盡相同。選擇何種保藏方法取決於實驗室現有的設備和保藏要求。

傳代培養法

保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養基（用於厭氧細菌）培養好後，將菌種管的棉塞換成橡膠塞，用石蠟封口，至於4℃冰箱中或室溫下存放，定期進行傳代培養。當固體斜面或液體培養物用盡後，可從半固體穿刺培養物中接種斜面再培養後保存，但要注意無菌操作。

保藏的時間依微生物的種類而定。黴菌、放線菌及芽孢菌保存2個月~4個月移種1次，酵母菌間隔2個月，普通細菌1個月，假單胞菌2周傳代1次。此法優點是操作簡單、使用方便，無需特殊設備，缺點是包場時間段、易被污染和發生變異。

液體石蠟保存法

原理是在菌的培養物表面覆蓋液體石蠟隔絕空氣，防止培養基水分的蒸發，降低呼吸作用，減少能量和物質代謝，延緩細菌的衰老，延長保存時間。

將化學純的液體石蠟油置於三角瓶中，高壓滅菌後，放於40℃烘箱中過夜，烘去水分，加在已長好菌的斜面或半固體上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕，管口換成無菌的橡皮塞。將試管直立，置4℃或室溫下保存。

此法使用且效果較好。黴菌、放線菌、芽孢桿菌可保藏2年以上，酵母菌可保藏1年~2年，普通細菌也可保藏1個月~1年左右。注意：從液體石蠟下面取培養物移種後須在火焰上灼燒時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺。

載體法

微生物菌體吸附在一定的載體上進行乾燥後保藏。多用於產芽孢或孢子的微生物、芽孢桿菌、黴菌和放線菌。在抗生素工業生產中應用廣泛、效果好，可保存2年時間，但不能用於保藏營養細胞。

常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。

砂土管保藏法的步驟：

（1）河沙處理

將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，將放入容器中用10%鹽酸浸泡24h或加熱煮沸30min除去有機機質。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最後一次用蒸餾水沖洗，烘乾或曬乾，備用。

2）土壤處理

取非耕作層不含腐殖質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。烘乾後碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。

（3）砂土混合

處理妥當的沙與土按2:1的比例摻和（或根據需要而用其他比例，甚至可全部作沙或土）均勻後，裝入小試管或安剖瓶中，高度為1cm左右，塞上棉塞，進行滅菌（通常採用間歇滅菌2次~3次） ，最後烘乾。

（4）無菌檢查

每10支沙土管隨機抽取1支，將沙土倒入肉湯培養基中，30℃培養40h，若發現有微生物生長，所有砂土管則需重新滅菌，再做無菌試驗，直至證明無菌後方可使用。

（5）懸菌液的製備

向培養好的斜面培養物中加入2ml~3ml無菌水，將菌苔洗下，製成菌懸液。

（6）分樣樣品

每支沙土管（註明標記後）加入0.5ml菌懸液（剛剛使沙土潤濕為宜），拌勻。

（7）乾燥

將裝有懸菌液的沙土管放入乾燥器內，乾燥器底部盛有乾燥劑（五氧化二磷或無水氯化鈣）。用真空泵抽乾水分後火焰封口（也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口）。

（8）保存

置於4℃冰箱或室溫乾燥處，每隔一段時間進行檢測。

（9）純度檢查

從做好的沙土管中，按10:1比例抽查。無菌條件下用接種環取出少量沙土粒，接種於適宜的固體培養基上，培養後觀察其生長情況和有無雜菌生長。如出現雜菌或菌落數很少，或根本不長，則須進一步抽樣檢查。

（10）復活

無菌條件下打開沙土管，取部分砂土粒於適宜的斜面培養基上，長出菌落後再轉接一次，也可沙土粒於適宜的液體培養基中，增殖培養後再轉接斜面。