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角蛋白酶
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角蛋白酶

中文名稱 :角蛋白酶

外文名稱 :keratinase

定 義 :專一地降解角蛋白的蛋白酶類

前 景 :環境治理方面等

角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶bai類,在飼料、皮革、醫藥業、食品等工業及環境治理方面具有廣闊的應用前景。角蛋白酶大多數屬於細胞外酶,個別為細胞內酶。目前已純化的角蛋白酶以中性和鹼性蛋白酶居多,其最適pH值多在7.5以上。但也有少數是酸性蛋白酶。角蛋白酶可由細菌、放線菌和真菌等多種微生物產生。角蛋白酶來源不同,其結構、理化性質、活性和底物也不同。美國北卡州立大學Shih教授等對地衣芽孢桿菌所產生的角蛋白酶的研究處於世界最前沿。他們成功地獲得了第1例具有開發價值的菌株——B.licheniformis PWD1(Wang et al.,1999)。印度的 Radha等(2009)在B.licheniformis中克隆到編碼MKU3角蛋白酶的基因,它由1140 bp的核苷酸組成,序列分析推測這個片段的開放閱讀框有1137個核苷酸,氨基酸序列由379個氨基酸組成,其中包括29個殘基的信號肽和350個殘基的原蛋白。

發現年代

角蛋白酶(keratinase)是一種誘導酶,只有當環境中出現誘導子(角蛋白)時才會合成。早在19世紀初人們就發現一些生物能降解角蛋白,自那時以來分離此類菌株的工作一直在進行。目前發現可降解角蛋白的微生物已有30多種,其中有細菌、放線菌和真菌。細菌中主要是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),放線菌中主要是高溫單胞菌屬(Thermmonospora)和鏈黴菌(Streptomyces),真菌中主要是白色假絲酵母和一些皮膚真菌。不同微生物產生的角蛋白酶具有一定的差異,主要表現在酶的存在方式以及酶的結構、組成、穩定性、最適反應溫度、pH值等方面。例如角蛋白酶的存在形式,有的主要存在於胞內,有的主要分泌至胞外,而黴菌的角蛋白酶既可見於胞內又可分泌至胞外。

產酶微生物

目前已發現30餘種微生物可分泌角蛋白酶,這些微生物主要來自於真菌、放線菌和細菌,如真菌中的皮膚癬菌(Dermatophyte)和白色假絲酵母(Cnadina albicans),放線菌中的鏈黴菌(Streptomyces),細菌中的地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等等。[1]

真菌

真菌是最早被發現的能夠產角蛋白酶的微生物。早在1899年,Ward就報道了Onygena equina(馬爪甲團囊菌)能分解角蛋白。許多皮膚真菌類的微生物都有產角蛋白酶的功能,包括須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、微孢長囊頭孢黴菌(Doratomyces microsporus)[12]、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、雞禽毛癬菌(Poultries Trichophyton)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)和白念珠菌(Monilia albicans)、黃麴黴(Aspergillus flavus)、熱帶念珠菌(Oidium tropioale)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)等。皮膚真菌附着於皮膚後,首先會利用角蛋白酶將皮膚的角質降解,降解後產生了各種短肽和氨基酸,作為真菌生長的碳源和氮源。然後進一步侵入皮膚進行繁殖、感染,進而形成皮膚病。目前,一些有關致病真菌的研究已經日益展開,同時對角蛋白的降解機理和相關研究也起到了積極的作用。除皮膚真菌外,還有一些其他真菌具有降解角蛋白的功能。Anbu等(2004)發現了一種產角蛋白酶的能力的短尾帚霉(Scopulariopsis brevicaulis),並對這種角蛋白酶進行分離純化。Singh等研究了21種產角蛋白酶的真菌,發現其中猴髮癬菌(Trichophyton simii)降解羽毛角蛋白的能力最強。羅文等從土壤中分離出一株能降解羽毛粉角蛋白的黴菌,初步鑑定為串孢屬菌(Catenularia sp.)。Santos報道了分離到降解羽毛角蛋白的煙麴黴(Aspergillus fumigatus),它可以利用羽毛角蛋白作為唯一碳源和氮源生長。

放線菌

產角蛋白酶的放線菌以鏈黴菌為主要代表,如弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradia)、黃白鏈黴菌(Streptomyces alboflavus)K1-02、鏈黴菌(Streptomyces)DSM 40530和嗜熱鏈黴菌(Streptomyces thermophilus)等。丁正民等(1993)從雞毛堆肥中分離純化到一放線菌菌株SS-1,該菌有很強的降解雞毛的能力[26]。塗國全等(1994)篩選出了角蛋白分解菌株S22-1,該菌能迅速分解羽毛、人發等多種角蛋白。根據該菌的培養特性、形態特徵、生理生化特性的測定結果與已知的弗氏鏈黴菌形態特徵、生理生化特性相似,但在培養特性和分解利用羽毛角蛋白的特性上有較大差異,因此被初步鑑定為弗氏鏈黴菌的一個變種。

細菌

目前已經篩選和分離到很多能降解角蛋白的細菌,主要為芽孢桿菌。Williamsh等(1989)由家禽羽毛髮酵液中富集、分離到了羽毛分解菌,經鑑定為嗜熱型地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),這種菌在以羽毛作為其主要的碳氮源的培養基條件下生長最適宜,但不能降解未經高溫蒸煮的羽毛。其他芽孢桿菌包括嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)等。另外具有角蛋白酶活性的細菌還有嗜熱厭氧菌、弧菌科細菌(Vibrionaceae)、海島閃光桿菌、金黃桿菌屬等。細菌生長快、易於繁殖、產酶活性高,角蛋白酶最適溫度、pH值等性質特異,具有良好的應用潛力。

理化性質

目前已分離純化的角蛋白酶的分子量差異較大,從十幾kDa到幾百kDa不等。較小的為單體酶,有報道來自Nesternkonia spAL-20的角蛋白酶,分子量為18kDa,較大的為複合酶,如嗜熱厭氧菌產的角蛋白酶可達200kDa以上。大部分角蛋白酶的分子量集中在30~70kDa之間,如HSIN-HUNG LIN報道的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產的角蛋白酶大小為30kDa,嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas maltophilia)產的角蛋白酶大小為36kDa,近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的角蛋白酶為60kDa。枯草芽孢桿菌產角蛋白酶的分子量為60kDa 。

底物特異性

角蛋白酶作用的底物除了角蛋白外,它還可水解多種蛋白質底物,包括可溶和不可溶的蛋白質。角蛋白酶可以降解如酪蛋白、明膠、牛血清白蛋白等可溶的蛋白質。也可以降解包括羽毛、羊毛、角質、人發、指甲等不可溶的蛋白質。個別角蛋白酶的底物範圍很窄,例如雞毛癬菌角蛋白酶只能降解鳥類羽毛,較難降解其它種類的角蛋白。

反應條件

角蛋白酶的最適反應pH以中性到鹼性居多,一般為7到10之間。個別角蛋白酶最適pH可達到12左右。酸性角蛋白酶比較少,大都為某些真菌,如鬚毛蘚菌產的角蛋白酶最適pH為5.5,白色假絲酵母為4.0。角蛋白酶的最適反應溫度一般在40℃~60℃,如Microbacterium的最適溫度在55℃,也有溫度要求較低或較高的角蛋白酶類,如Stenotrophomonas sp. D1.為20℃,而Fervidobacterium islandicum AW-1的膜結合角蛋白酶的最適溫度高達100℃。

活性測定方法

角蛋白不溶性於水及大部分有機溶劑,使得角蛋白酶活性測定比一般蛋白酶困難。常用測定角蛋白酶的原理是以底物水解後釋放的氨基酸的量來確定角蛋白酶的活性。目前測定角蛋白酶的方法主要有三種,一種是直接用角蛋白粉作為底物進行測定,塗國全等(1998)曾以羽毛粉作為測定角蛋白酶的底物[59]。第二種是使用經過修飾的底物進行酶活測定,該方法中作為底物使用的角蛋白被連接上生色基團,通過測定底物水解後放出的生色物質的含量可以判斷酶的活性。具有代表性的兩種底物是偶氮角蛋白[62]和天青角蛋白[63],前者將偶氮連接於羽毛角蛋白上的自由氨基酸殘基,後者為羊毛角蛋白與三甲基硫堇結合的產物。第三種則是以可溶性的羽毛角蛋白作為底物表徵角蛋白酶的活性,該方法由Wawrzkiewicz提出並被廣泛採用。它是利用二甲基亞碸溶解羽毛角蛋白,再用異丙醇經行沉澱,乾燥後的可溶性角蛋白溶解於相應的緩衝液中作為底物。

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