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中文名称 ：角蛋白酶 外文名称 ：keratinase 定 义 ：专一地降解角蛋白的蛋白酶类 前 景 ：环境治理方面等 |
角蛋白酶（Keratinase）是一种可以特异性降解角蛋白的酶bai类，在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。角蛋白酶大多数属于细胞外酶，个别为细胞内酶。目前已纯化的角蛋白酶以中性和碱性蛋白酶居多，其最适pH值多在7.5以上。但也有少数是酸性蛋白酶。角蛋白酶可由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。角蛋白酶来源不同，其结构、理化性质、活性和底物也不同。美国北卡州立大学Shih教授等对地衣芽孢杆菌所产生的角蛋白酶的研究处于世界最前沿。他们成功地获得了第1例具有开发价值的菌株——B.licheniformis PWD1（Wang et al.，1999）。印度的 Radha等（2009）在B.licheniformis中克隆到编码MKU3角蛋白酶的基因，它由1140 bp的核苷酸组成，序列分析推测这个片段的开放阅读框有1137个核苷酸，氨基酸序列由379个氨基酸组成，其中包括29个残基的信号肽和350个残基的原蛋白。
发现年代
角蛋白酶(keratinase)是一种诱导酶，只有当环境中出现诱导子(角蛋白)时才会合成。早在19世纪初人们就发现一些生物能降解角蛋白，自那时以来分离此类菌株的工作一直在进行。目前发现可降解角蛋白的微生物已有30多种，其中有细菌、放线菌和真菌。细菌中主要是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，放线菌中主要是高温单胞菌属(Thermmonospora)和链霉菌(Streptomyces)，真菌中主要是白色假丝酵母和一些皮肤真菌。不同微生物产生的角蛋白酶具有一定的差异，主要表现在酶的存在方式以及酶的结构、组成、稳定性、最适反应温度、pH值等方面。例如角蛋白酶的存在形式，有的主要存在于胞内，有的主要分泌至胞外，而霉菌的角蛋白酶既可见于胞内又可分泌至胞外。
产酶微生物
目前已发现30余种微生物可分泌角蛋白酶，这些微生物主要来自于真菌、放线菌和细菌，如真菌中的皮肤癣菌(Dermatophyte)和白色假丝酵母(Cnadina albicans)，放线菌中的链霉菌(Streptomyces)，细菌中的地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等等。[1]
真菌
真菌是最早被发现的能够产角蛋白酶的微生物。早在1899年，Ward就报道了Onygena equina(马爪甲团囊菌)能分解角蛋白。许多皮肤真菌类的微生物都有产角蛋白酶的功能，包括须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、微孢长囊头孢霉菌(Doratomyces microsporus)[12]、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、鸡禽毛癣菌(Poultries Trichophyton)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)和白念珠菌(Monilia albicans)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、热带念珠菌(Oidium tropioale)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)等。皮肤真菌附着于皮肤后，首先会利用角蛋白酶将皮肤的角质降解，降解后产生了各种短肽和氨基酸，作为真菌生长的碳源和氮源。然后进一步侵入皮肤进行繁殖、感染，进而形成皮肤病。目前，一些有关致病真菌的研究已经日益展开，同时对角蛋白的降解机理和相关研究也起到了积极的作用。除皮肤真菌外，还有一些其他真菌具有降解角蛋白的功能。Anbu等(2004)发现了一种产角蛋白酶的能力的短尾帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)，并对这种角蛋白酶进行分离纯化。Singh等研究了21种产角蛋白酶的真菌，发现其中猴发癣菌(Trichophyton simii)降解羽毛角蛋白的能力最强。罗文等从土壤中分离出一株能降解羽毛粉角蛋白的霉菌,初步鉴定为串孢属菌(Catenularia sp.)。Santos报道了分离到降解羽毛角蛋白的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，它可以利用羽毛角蛋白作为唯一碳源和氮源生长。
放线菌
产角蛋白酶的放线菌以链霉菌为主要代表，如弗氏链霉菌(Streptomyces fradia)、黄白链霉菌(Streptomyces alboflavus)K1-02、链霉菌(Streptomyces)DSM 40530和嗜热链霉菌(Streptomyces thermophilus)等。丁正民等(1993)从鸡毛堆肥中分离纯化到一放线菌菌株SS-1，该菌有很强的降解鸡毛的能力[26]。涂国全等(1994)筛选出了角蛋白分解菌株S22-1，该菌能迅速分解羽毛、人发等多种角蛋白。根据该菌的培养特性、形态特征、生理生化特性的测定结果与已知的弗氏链霉菌形态特征、生理生化特性相似，但在培养特性和分解利用羽毛角蛋白的特性上有较大差异，因此被初步鉴定为弗氏链霉菌的一个变种。
细菌
目前已经筛选和分离到很多能降解角蛋白的细菌，主要为芽孢杆菌。Williamsh等(1989)由家禽羽毛发酵液中富集、分离到了羽毛分解菌，经鉴定为嗜热型地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，这种菌在以羽毛作为其主要的碳氮源的培养基条件下生长最适宜，但不能降解未经高温蒸煮的羽毛。其他芽孢杆菌包括嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。另外具有角蛋白酶活性的细菌还有嗜热厌氧菌、弧菌科细菌(Vibrionaceae)、海岛闪光杆菌、金黄杆菌属等。细菌生长快、易于繁殖、产酶活性高，角蛋白酶最适温度、pH值等性质特异，具有良好的应用潜力。
理化性质
目前已分离纯化的角蛋白酶的分子量差异较大，从十几kDa到几百kDa不等。较小的为单体酶，有报道来自Nesternkonia spAL-20的角蛋白酶，分子量为18kDa，较大的为复合酶，如嗜热厌氧菌产的角蛋白酶可达200kDa以上。大部分角蛋白酶的分子量集中在30~70kDa之间，如HSIN-HUNG LIN报道的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)产的角蛋白酶大小为30kDa，嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)产的角蛋白酶大小为36kDa，近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的角蛋白酶为60kDa。枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的分子量为60kDa 。
底物特异性
角蛋白酶作用的底物除了角蛋白外，它还可水解多种蛋白质底物，包括可溶和不可溶的蛋白质。角蛋白酶可以降解如酪蛋白、明胶、牛血清白蛋白等可溶的蛋白质。也可以降解包括羽毛、羊毛、角质、人发、指甲等不可溶的蛋白质。个别角蛋白酶的底物范围很窄，例如鸡毛癣菌角蛋白酶只能降解鸟类羽毛，较难降解其它种类的角蛋白。
反应条件
角蛋白酶的最适反应pH以中性到碱性居多，一般为7到10之间。个别角蛋白酶最适pH可达到12左右。酸性角蛋白酶比较少，大都为某些真菌，如须毛藓菌产的角蛋白酶最适pH为5.5，白色假丝酵母为4.0。角蛋白酶的最适反应温度一般在40℃~60℃，如Microbacterium的最适温度在55℃，也有温度要求较低或较高的角蛋白酶类，如Stenotrophomonas sp. D1.为20℃，而Fervidobacterium islandicum AW-1的膜结合角蛋白酶的最适温度高达100℃。
活性测定方法
角蛋白不溶性于水及大部分有机溶剂，使得角蛋白酶活性测定比一般蛋白酶困难。常用测定角蛋白酶的原理是以底物水解后释放的氨基酸的量来确定角蛋白酶的活性。目前测定角蛋白酶的方法主要有三种，一种是直接用角蛋白粉作为底物进行测定，涂国全等(1998)曾以羽毛粉作为测定角蛋白酶的底物[59]。第二种是使用经过修饰的底物进行酶活测定，该方法中作为底物使用的角蛋白被连接上生色基团，通过测定底物水解后放出的生色物质的含量可以判断酶的活性。具有代表性的两种底物是偶氮角蛋白[62]和天青角蛋白[63]，前者将偶氮连接于羽毛角蛋白上的自由氨基酸残基，后者为羊毛角蛋白与三甲基硫堇结合的产物。第三种则是以可溶性的羽毛角蛋白作为底物表征角蛋白酶的活性，该方法由Wawrzkiewicz提出并被广泛采用。它是利用二甲基亚砜溶解羽毛角蛋白，再用异丙醇经行沉淀，干燥后的可溶性角蛋白溶解于相应的缓冲液中作为底物。
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