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黄曲霉素
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1993年,黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)癌症研究机构划定为一类天然存在的致癌物,是毒性极强的剧毒物质。
==AF的毒性及危害==
===AF的致突变性===
黄曲霉毒素具有致突变性,能使人成纤维细胞发生程序外DNA合成,动物实验可见染色体畸变,染色体断裂,某些染色体4q、13q、14p发生缺失。AFB1是一种能导致生物体遗传物质发生变化的致突变化合物,但 AFB1本身不能引起突变,而必须在机体内经过代谢活化后才具有致突变作用,称为间接致突变物。AFB1由肝微粒体酶活化为亲电子物,即AFB1-2,3-环氧化物,该环氧化物的第2个碳与DNA的鸟嘌呤酮基结合形成 AFB1-DNA加合物,此外,AFB1的代谢产物AFM1和AFP1也能转化成亲电子物而与DNA结合,AFB1-DNA加合物经去嘌呤反应形成AFB1-N7-鸟嘌呤,使DNA分子产生无嘌呤位置的缺口,因而造成DNA的损伤。 [2] 目前认为无论是DNA去嘌呤造成的损伤还是由于经酸、碱水解不断蓄积开环加合物而使DNA分子发生的改变,都是突变前的一种改变,都有进一步发展为癌症的可能性。 [2]
===对肝脏的危害===
黄曲霉毒素是一种剧毒的致肝癌物质,其中黄曲霉毒素B1可引起细胞错误地修复DNA,导致严重的DNA诱变,还可抑制DNA和RNA的合成,从而抑制蛋白质的合成。从我国肝癌流行病学调查研究中发现,某些地区人群膳食中黄曲霉毒素的污染水平与原发性肝癌的发生率呈正相关。专家对其他肝癌发病率高的地区进行调查,也得出相同结论。乙型肝炎病毒和黄曲霉毒素B1是我国诱发肝癌的两大主要危险因素,有关肿瘤研究专家通过建立乙肝病毒和黄曲霉毒素B1致肝癌机理的实验模型,利用这些模型发现单独存在的乙肝病毒基因并不能诱发小鼠肝癌,但乙肝病毒基因可增强黄曲霉毒素B1的致癌效应,两者均可使肝细胞处于较活跃的增殖状态,在致肝癌过程中具有明显的协同作用。
===其他方法===
(1)溴化荧光分光光度法(SFB)
样品经甲醇-水混合溶剂提取后,部分提取液通过固相分离进行柱前处理,500μL纯化的提取液用溴试剂衍生化后,用荧光检测计中检测,样品荧光吸收度与硫酸喹啉液的吸收度比较可直接换算成AF的总含量。该法已通过AOAC和美国农业部联邦谷物检测中心的认证。 [3]
(2)超光谱方法(HS)
超光谱法是基于反射能基础上的一种非侵入无破坏的映像技术,用于农产品检测中,能够快速地提供该产品的有关化学和其他方面的内部细节。另据研究报道,培训黄蜂可用于AF检测。由于AF主要是由黄曲霉产生的,寄生黄蜂通过培训能把黄曲霉的气味和糖水联系起来,并对这些气味产生有区别的行为反应,借此来识别目标气味的存在。这种培训反应正在应用于储藏玉米、花生的AF监控和检测实践当中,目前还未给出有关的结果评定。 [3] === 各方法对比===薄层层析法对样品处理繁琐,实验过程复杂,所需时间多,易受杂质干扰,较适合于对AF的定性检测,是研究AF初期所使用的主要方法。今后,虽然薄层层析法在不断地改进,并在一般实验室均可完成操作,但由于它复杂的前处理过程致使在应用中仍然会受到一定程度的限制。 [3] 高效液相色谱法测定AF,技术水平要求较高,目前采用这种方法检测AF较多,但具体一次实验所使用的化学药剂和处理途径差别很大,对实验结果的精度造成影响,这种方法还应在实践中进一步改进。但总体上说高效液相色谱法操作较为简便,同时可检测多个AF种类,适于大批量样品的分析。将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用,是目前采用较多的一种方法,今后将被广泛应用。 [3] 微柱法测定AF,主要是用来检验AF的存在与否以及快速筛选出超标样品,而要对AF种类进行区分定量检验,则需要对不同AF组分进行分离,再利用其他方法检测。因此,微柱法并不能完成整个AF检测过程,仅适用于定性检验。 [3] 酶联免疫吸附法操作简便,使用较为安全,但由于酶本身的不稳定性,用此方法检验AF有可能带来假阳、阴性结果,而且研制出的AF快速测试盒多以测定最具毒性的种属为主,食品和饲料工业上利用它来界定食品或饲料中AF的超标问题。酶联免疫吸附法的检测精度还有待于提高。 [3] 溴化荧光分光光度法的最大优点是检测时不使用AF对照品,同时快速、灵敏,适合大批量样品普查,仪器价格也较低,张雪辉等比较了用SFB法和溴衍生HPLC检测中药中AF的结果,发现SFB法在测定中药时可能出现许多假阳性结果。 [3]
==AF的去除措施==
===碾磨搓洗===
碱炼是油脂精炼的一种加工方法,在油脂中加入1%NaOH溶液,AF内酯环即可破坏,形成香豆素钠盐。后者可溶于水,故加碱后再用水洗可将毒素去除。加碱水洗可使油中AF降至标准以下,甚至不能检出。 [3]
===有机溶剂萃取法===
AF为脂溶性毒素,易溶于有机溶剂,可用水合乙醇、异丙醇、丙酮、正己烷和水的混合物等进行提取分离、去毒。提取需反复3~5次,去毒效果可达90%以上,其中以丙酮和水(90∶ 100)混合液效果最好。处理后的粮油制品,必须将溶剂彻底挥干,方可食用。 [3]
===氧化降解法===
漂白粉、氯气、双氧水、臭氧等氧化剂可以迅速将AF氧化去除,其中以漂白粉去毒效果最强。高度污染的花生粉可用5%漂白粉处理几秒钟就可以全部去毒,用氧化剂处理过的粮食经火鸡喂养试验证明无毒。 [3]
===二氧化氯法===
霉变染有AFB1的玉米,用250μg/mL低浓度的二氧化氯浸泡30~60min,能有效地解除AFB1的毒性。 [3]
===中草药去毒法===
1976年我国首次发现山苍子中的挥发油可以彻底除去食品中的AF。挥发油中的某些成分与AF可发生加成和缩合反应,改变毒素分子结构,达到去毒目的。AF超过国家标准20倍的玉米、稻谷或超标2500倍的花生经大剂量山苍子芳香油处理可一举去毒。此法简便易行,特别适合家庭应用,并对食品质量和营养成分无任何影响。另外,甘草、葫芦巴、羽扁豆、茴香、五香粉、大蒜等也有去除AF的作用。 [3]
===生物学方法===
乳酸菌粘附法是通过乳酸菌自身粘附作用和所分泌的代谢产物的抑菌作用,来去除AF。由乳酸菌产生的乳酸链球菌素具有粘附、降解AF的作用。 [3] 乳酸菌广泛地应用在食品发酵工业中,具有改善肠道微生态,防腐和治疗功效。乳酸菌能分泌许多抗菌物质,阻止病原菌的生长。其他微生物如枯草杆菌、乳酸菌、醋酸菌等对AF降解能力最强,在液体培养基60h后,可分别除去89%、88%和81%。 [3]
===酶解法===
酶的降解去毒主要利用酶的专一性,高效地催化、降解AF为无毒化合物或小分子无毒物质的方法。酶降解去除黄曲霉素效果好,实用性强,适合于各种形式受到污染的食品,必将成为今后研究和应用的热点。 [3]
==黄曲霉菌生长条件==
产生黄曲霉毒素的最基本条件是产毒真菌的存在。经过大量实验证明,能产生AF的真菌主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌,而黄曲霉菌是一种广泛分布于世界各地区的比较常见的腐生菌,适宜的条件是它产生毒素的温床。影响曲霉菌生长繁殖及产毒的因素有很多,与食品关系密切的主要有水分、温度、食品基质、通风条件等。 [2]
===水分===
水分是微生物生存不可或缺的,食品中水分以结合水和游离水两种状态存在,结合水存在于食品的组织本身,它是活组织的一部分,是细胞所有生理过程所必需的。而微生物能利用的水分是游离水。一般来说,米麦类水分在14%以下,大豆类在11%以下,干菜和干果类在30%以下,微生物生长比较困难,食品中真正能被微生物利用的那部分水称为水分活性(Water activity,缩写 Aw),纯水的 Aw为1.0(相当于相对湿度100%),当Aw值越小时,细菌能利用的水越少,水分活性越接近1,微生物就越易生长繁殖,当食品中的Aw 为0.98 时,微生物最易生长繁殖,当Aw降为0.93时,微生物繁殖受到抑制,但霉菌仍能生长,当Aw小于0.7时,则霉菌的生长受到一定抑制,可以阻止产毒的霉菌繁殖。 [2]
===温度与通风===
温度对霉菌的繁殖和产毒均有重要影响,不同种类的霉菌最适温度是不一样的。在相对湿度为80%~90% ,大多数霉菌繁殖最适宜的温度是25~30℃ ,在0℃以下不能产毒。如黄曲霉的最低繁殖温度范围是6~8℃,最高繁殖温度是44~46℃,最适宜生长温度是37℃左右,产毒温度略低于最适宜生长温度,为25~32℃。缓慢通风比快速风干的霉菌容易繁殖产毒。 [2] === 食品基质===与其他微生物生长繁殖的条件一样,菌株腐生的基质也很重要。不同的食品基质霉菌的生长情况不同,一般来说,营养丰富的食品,霉菌生长的可能性就大,天然基质比人工培养基质的产毒效果好。 [2]
==生物防治剂==
许多细菌和真菌,如乳酸菌、芽孢杆菌、橙黄杆菌、酵母等均有抑制黄曲霉生长和产毒的能力。 [7] === 乳酸菌===研究表明,乳酸菌属的许多菌株,包括Lactobacillus、Bifi-dobacterium、Propionibacteri-um和Lactococcus等均被报道具有吸附黄曲霉毒素的作用。尽管乳酸菌能吸附黄曲霉毒素,但这种吸附可能是可逆的,易造成毒素的残留;再者乳酸菌属厌氧菌,在实际应用过程中难以保证厌氧的环境,从而限制了乳酸菌作为拮抗菌的实际应用。 [7] === 芽孢杆菌===枯草芽孢杆菌产生的抑菌物质具有较好的耐热性,若能将其分泌的活性物质进行纯化和鉴定,并将其活性物质用于黄曲霉毒素污染的控制,将给农作物的生产带来巨大的效益。 [7] === 橙黄杆菌===橙黄杆菌是一类研究得较早的生防菌,早在20世纪六、七十年代,有学者发现橙黄杆菌的细胞培养物能移去水溶液中的黄曲霉毒素B1;其死细胞移除黄曲霉毒素B1的能力受温度和pH的影响,活细胞吸附的黄曲霉毒素B1则不能被液相萃取出来。此外,红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)和分支杆菌(Mycobacterium fluoranthenivorans)的无细胞抽提液能显著降低食品和饲料中的黄曲霉毒素B1。橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)是好氧革兰氏阴性棒状菌,广泛存在于土壤中。它们分泌的胞外产物可以分解不同的生物大分子和整个微生物体。 [7] === 不产毒的黄曲霉和寄生曲霉===采用不产毒的黄曲霉和寄生曲霉可有效防治作物收获前黄曲霉毒素并已得到应用。早在1992年,有学者就已经提出将不产毒的寄生曲霉菌株播撒在花生生长的土壤中能够使花生黄曲霉毒素含量降低83%~85%。同样,在土壤中引入不产毒的黄曲霉菌株也可以降低棉花种子中的黄曲霉毒素含量。近年来,美国环境保护协会还注册了两株不产毒的黄曲霉菌株来防治棉花和花生黄曲霉毒素污染问题,并在美国多个州的试验田中广泛试用。在非洲、澳大利亚和中国,亦筛选出能有效抑制黄曲霉毒素产生的不产毒黄曲霉菌株,这些菌株能使田间产毒菌株的数量降低95%以上。 [7] 通过引入黄曲霉和寄生曲霉来控制土壤中的微生物菌群,在农作物生长过程中优先替代了土壤中原有的产毒菌株,对于降低收获前黄曲霉毒素的污染是很有效的。早期的田间试验直接将不产毒菌株的孢子悬液与种子浸泡后播种或者直接将孢子悬液喷洒到土壤中,虽然效果十分明显,但成本较高;近年来,则采用谷类固态发酵的方法孵育孢子,孵育完成后在50℃下烘干,5℃贮存备用。土壤温度是影响生物防治黄曲霉毒素污染效果的重要因素之一,在实验室内,黄曲霉孢子萌发的温度需高于10℃;但在试验田内,温度需高于20℃时孢子才会萌发,因此,必须等到土壤温度高于20℃时才能将不产毒的菌株应用到试验田。不同地区应根据具体情况确定施用日期。 [7] 尽管很多不产毒的黄曲霉和寄生曲霉菌株已成功应用于田间防治黄曲霉毒素污染,但采用直接接种孢子的方法会改变田间的微生物菌群,甚至将影响到正常菌群的生长,这势必会影物的产量。此外,该方法只能在土壤温度高于20℃时才能应用,对于多季种植作物的地区,其应用受到了限制。 [7] === 酵母===实验表明,腐生型酵母,如假丝酵母属(Candida)和毕赤酵母属(Pichia)的一些种能够在很大程度上抑制黄曲霉的生长,但能否有效地用于田间还有待进一步研究。 [7] === 食用菌===有学者将平菇(Pleurotus ostreatus)和黄曲霉共培养,结果表明平菇能抑制黄曲霉的生长;在稻草和玉米芯中感染黄曲霉3周后再接种平菇能使稻草和玉米芯的黄曲霉毒素含量降低。平菇可以产生一种分子量为90kD的胞外酶,并通过薄层层析证明该酶能有效地降解AFB1,荧光测定显示该酶能够催化AFB1内酯环的打开,从而达到降解毒素的作用。 [7] 黄曲霉毒素解毒酶是目前为止降解黄曲霉毒素效率较高的物质,是从食用菌中提取出的酶类,具有较高的安全性,只是该酶的产量还需进一步提高,广泛应用于生产还有一段距离。 [7] === 其它真菌===有报道显示,绿色木霉(Trichoderm viride)、不明毛霉(Mucor ambiguus)以及少数其他真菌对AFB1也有很好的降解能力。然而其中一些菌株在条件改变的情况下有可能产生AFB。研究表明,黑曲霉(Aspergillus niger)及其突变菌株与产毒黄曲霉混合对峙培养时,野生型虽然对黄曲霉生长只有微弱的抑制,但其可使黄曲霉产毒和合成色素能力下降;而突变株有较强抑制黄曲霉生长的能力。 [7] === 药用植物提取液===药用植物中含有许多有效抑菌成分,大量研究表明,将药用植物与农作物实行间作栽培可以有效地抑制黄曲霉的生长,降低作物被黄曲霉毒素污染的几率。 [7]
有学者从药用植物三齿拉瑞阿(Larrea tridentata)中分离到抗菌物质木酚素,能显著抑制黄曲霉生长。此外,黄花(Sida acuta)、翅果铁刀木(Senna Alata)、肉桂(Cinnamomum cassia)、柠檬、石香薷(Mosla chinensis)、山核桃(Carya cathayensis)及杜仲(Eucommia ulmoides)等药用植物对黄曲霉孢子的萌发及菌丝的生长都有抑制作用。上述几种药用植物除了石香薷外大多都是木本植物,虽说在临床治疗方面有广泛的应用前景,但对田间作物的生物防治则很难推广。
==参考文献==