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| 雜交探針 |
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中文名: 雜交探針 定 義: 一小段單鏈DNA片段 用 途: 檢測與其互補的核酸序列 應用領域: 生物遺傳 |
雜交探針是一小段單鏈DNA片段（十幾到幾百個鹼基），用於檢測與其互補的核酸序列。
雜交探針是核酸分子上帶有可能被檢測的信號分子，如同位素或熒光標記的核酸分子。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨後用放射性同位素（通常用磷-32）、螢光染料或者酶（如辣根過氧化物酶）標記成為探針。磷-32通常被摻入組成DNA的四種核苷酸之一的磷酸基團中，而熒光染料和酶與核酸序列以共價鍵相連。分為cDNA探針，基因組DNA探針，寡核苷酸探針，RNA探針。
當將探針與樣品雜交時，探針和與其互補的核酸（DNA或RNA）序列通過氫鍵緊密相連，隨後，未被雜交的多餘探針被洗去。最後，根據探針的種類，可進行放射自顯影、螢光顯微鏡、酶聯放大等方法來判斷樣品中是否，或者何位置含有被測序列（即與探針互補的序列）。
雜交前探針的選擇
RNA探針
RNA探針的長度以50-150鹼基為佳，探針易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。長500個鹼基的探針雜交時間約需20個小時左右，如超過500個鹼基的RNA探針則在雜交前用有限鹼基水解法控制其長度。
（1）孵育時間t = Lf- Lo / K × Lo ×Lf （Lo=核酸探針原長度（kb），Lf=核酸探針水解後所需長度（kb），K是常數率=0.11 kb/min）。
（2）在室溫中加入下列試劑終止水解：3 mol/L醋酸鈉，6.6 μl（終濃度0.1 mol/L），醋酸1.3 μl（終濃度為0.5%）。
（3）加入下列試劑沉澱探針：7 mol/L醋酸銨100 μl，100%乙醇 750 μl，RNA （10 mg /ml） 2 μl ，置 -20℃ 2 小時後恢復到室溫，在1400 rpm離心30 min。
（4）小心將乙醇倒出，待試管內乾燥後再用無菌ddH2O稀釋到10 ng/μl濃度。
（5）最終探針長度可於10% 聚丙稀酰胺凝膠在60℃ 的尿素中電泳檢測。
探針的長度
原位雜交反應中探針濃度應超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為背景着色度高低與探針濃度有關。
最佳探針濃度是最低探針濃度達到靶核酸的最大飽和結合度為目的。探針濃度按其種類而略有不同，放射性標記cRNA探針的濃度為0.5 ng/μl，而非放射性標記cRNA探針的濃度1.0 ng/μl 。雜交液的量要適當，每張切片以30-50 μl為宜。保持雜交液不流失的關鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應用雜交罩等也很必要。
雜交的溫度和時間
設置和調整雜交溫度是RNA原位雜交的重要環節。雜交溫度應低於解鏈或融解溫度（melting temperature Tm）20-30℃。
多數RNA原位雜交Tm為95℃，由於這一溫度對保存組織形態完整和組織切片的粘附將產生不利影響，為此在雜交液中常以增加甲酰胺濃度來降低Tm值，因為每增加1% 甲酰胺濃度可降低0.72℃。另外雜交體中GC的百分比，雜交體長度以及雜交液中Na+的濃度也與Tm呈正相關。
雜交反應的時間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時間過短會造成雜交不完全，雜交時間過長會增加非特異性着色。一般RNA原位雜交採用雜交孵育過夜，在黑暗環境下進行，可以避免光線對甲酰胺的電離作用。[1]