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刺盘孢属(colletotrichum，又名炭疽菌属)，由corda在1831年建立，隶属于小丛壳目(glomerellales)、小丛壳科(glomerellaceae)。该属中大多数都是植物病原真菌，可以侵害多种农作物、经济作物和观赏植物等，形成以炭疽病为主的多种病害，被认为是世界十大重要植物病原真菌之一(deanetal.2012)。其中造成重大经济损失的病原菌包含咖啡浆果刺盘孢colletotrichumkahawaesubsp.kahawae、暹罗刺盘孢c.siamense、胶孢刺盘孢c.gloeosprioides、果生刺盘孢c.fructicola、平头刺盘孢c.truncatum、尖孢刺盘孢c.acutatum、博宁刺盘孢c.boninense、菜豆刺盘孢c.lindemuthianium、镰形刺盘孢c.falcatum等。其中，咖啡浆果刺盘孢c.kahawaesubsp.kahawae已被列入中国和 [[ 亚洲 ]] 其他国家以及拉丁美洲的一些国家检疫名录中，该种是造成整个非洲广泛种植的阿拉伯咖啡浆果病害的罪魁祸首，能够造成毁灭性的咖啡浆果炭疽病害，损失高达30％-70％，甚至绝产，是重要植物检疫对象。刺盘孢属病菌是检疫口岸检出频次最高的有害植物病原真菌之一。区分和鉴定刺盘孢属真菌对口岸检疫人员来说不仅任务繁重，而且是一个很大的挑战。

有害生物入侵的超前预警、快速检测、风险分析和科学控制是防范外来物种的核心内容，其中，有害生物鉴定是其中的首要环节。对咖啡浆果刺盘孢及其近缘种进行有效识别，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的 [[ 作用 ]] 。目前，进出境口岸对检疫性刺盘孢种类鉴定的主要流程是菌株分离、形态观察、序列测定和分析，但是这样的操作远远不能满足口岸部门对于有害病原菌高效、精准的检出要求。尽管现有技术中已有一些利用分子生物学手段进行刺盘孢属某些物种的特异性检测和鉴定，如：巢式pcr快速检测胶胞炭疽菌的体系建立及应用(cn201810429586.1)、一种定量检测芒果炭疽菌的方法(cn201810062983.x)、一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用(cn201510030095.6)、一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用(cn201510031690.1)。但是，这些方法每次只能检测一种刺盘孢属物种，普适性较差，在检疫性 [[ 鉴定 ]] 应用方面存在缺陷，不能满足口岸日常检测筛查的需要。

因此，建立刺盘孢属的属水平病原菌的特异、灵敏、快速和有效的分子检测方法在实践和应用研究中是十分必要的。技术实现要素：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种普遍适用于各种刺盘孢属 [[ 真菌 ]] 的特异、灵敏、快速的刺盘孢属真菌的鉴定方法。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过对刺盘孢属真菌物种、同科近缘属以及其它常见真菌(尤其是常见植物病原真菌)的基因组序列进行大量的分析和比对，确定了在刺盘孢属真菌中高度保守且具有属特异性的、能够很好地适用于各种刺盘孢属真菌的特异性靶序列以及特异性引物对和探针，该特异性引物对可以单独用于刺盘孢属真菌的pcr鉴定，也可结合特异性探针使用利用荧光定量pcr进行刺盘孢属真菌的鉴定。

上述特异性引物或特异性引物探针组合能够实现刺盘孢属真菌的特异、 [[ 灵敏 ]] 、准确、快速鉴定。具体地，第一方面，本发明提供一种用于鉴定刺盘孢属真菌的靶序列，其位于28srdna上，含有序列如seqidno.1-2所示的引物对特异性结合或扩增的核苷酸序列。本发明中，上述靶序列可通过序列如seqidno.1-2所示的引物对扩增得到，或者含有序列如seqidno.1-2所示的引物对能够特异性结合的核苷酸序列同时能够采用如seqidno.1-2所示的引物对或如seqidno.1-2所示的引物对经一个或多个碱基的缺失、替换或插入得到的引物对扩增得到。上述靶序列在刺盘孢属真菌中具有较高的保守性，尤其在特定位置具有高度的保守性，同时具有刺盘孢属真菌的属特异性，能够普遍通用于不同种刺盘孢属真菌的鉴定。上述特异性靶序列在不同的刺盘孢属真菌中存在部分位点的核苷酸序列差异，例如：当目标菌株为colletotrichumtruncatumcbs151.35时，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.4所示(genbank登录号jn940819第310-378位)，当目标菌株为colletotrichumcliviaecgmcc3.17358时，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.5所示。

第二方面，本发明提供所述的靶序列在鉴定刺盘孢属真菌中的应用。上述靶序列在鉴定刺盘孢属真菌中的应用为通过检测待测样本中是否含有所述靶序列，判断待测样本中是否含有刺盘孢属真菌或是否为刺盘孢属真菌。优选地，所述应用包括：检测待测样本的总dna中是否含有所述靶序列；如果含有所述靶序列，则待测样本含有或疑似含有刺盘孢属真菌，或者，是或疑似是刺盘孢属真菌；如果不含有所 [[ 述靶 ]] 序列，则待测样本不含有或疑似不含有刺盘孢属真菌，或者不是或疑似不是刺盘孢属真菌。第三方面，本发明提供鉴定刺盘孢属真菌的特异性引物对，包括序列如seqidno.1所示的正向引物和序列如seqidno.2所示的反向引物。上述特异性引物对与刺盘孢属靶序列具有高度的结合特异性和优异的扩增效率，能够保证pcr检测的特异性、灵敏度和准确性。上述特异性引物可以单独使用进行pcr检测，或者与特异性探针配合使用，进行荧光定量pcr检测。具体序列如下：正向引物(clf)：seqidno.1：5'-agagggttaaacagcacgtgaaa-3'；反向引物(clr)：seqidno.2：5'-gattcaccggacgcaagtct-3'。

第四方面，本发明提供含有所述鉴定刺盘孢属真菌的特异性引物对(seqidno.1-2所示)和序列如seqidno.3所示的探针的引物探针组合。上述特异性探针能够更好地与所述特异性引物对配合，进一步提高荧光pcr扩增的扩增效率，更好地保证荧光定量pcr检测的特 [[ 异性 ]] 、灵敏度和准确性。为满足荧光检测的需要，所述探针的一个末端标记有荧光报告基团，另一个末端标记有荧光淬灭基团。优选地，所述探针的5'末端标记有荧光报告基团，3'末端标记有荧光淬灭基团。作为本发明的一种实施方式，所述探针的5'端标记荧光报告基团fam，3'端标记荧光淬灭基团mgb。具体序列如下：探针(clp)：seqidno.3：5'-fam-tgttaaaagggaagcgctt-mgb-3'。

上述探针clp在完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团 [[ 吸收 ]] ；在进行刺盘孢属鉴定的pcr扩增时，taqdna聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步，可进行pcr产物形成的高效检测。本发明提供的上述靶序列、特异性引物对、引物探针组合能够普遍适用于多种刺盘孢属真菌的鉴定。第五方面，本发明提供所述特异性引物对或所述引物探针组合在制备鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒或鉴定刺盘孢属真菌中的应用。本发明中，所述鉴定刺盘孢属真菌包括鉴定待测菌是否为刺盘孢属真菌或鉴定待测样品中是否含有刺盘孢属真菌。优选地，所述特异性引物对或所述引物探针组合的应用包括如下任意一种：(1)鉴定刺盘孢属真菌；(2)制备用于鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒；(3)检测待测样本是否含有刺盘孢属真菌；(4)制备用于检测待测样本是否含有刺盘孢属真菌的试剂盒。第六方面，本发明提供一种鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒，包含所述特异性引物对或所述引物探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括dntps、pcr反应缓冲液、mg2+、dna聚合酶、 [[ 阳性 ]] 模板中的一种或多种。上述dntps、pcr反应缓冲液、mg2+、dna聚合酶各组分可以单独包装，或制备为预混液。所述预混液可制备为不同的浓度，如2×pcr预混液。所述预混液可以将包括dntps、pcr反应缓冲液、mg2+、dna聚合酶的pcr扩增组分混合制备或采用商品化的pcr预混液，例如abi公司的2×universalpcrmastermix。本发明还提供上述试剂盒的如下任意一种应用：(1)鉴定待测样本是否为刺盘孢属真菌；(2)鉴定待测样本是否含有刺盘孢属真菌。

第七方面，本发明提供一种鉴定刺盘孢属真菌的方法，以待测样品的dna为模板，利用所述特异性引物对或所述引物探针组合进行pcr扩增，根据扩增产物判断所述待测样品是否为刺盘孢属真菌或所述待测样品是否含有刺盘孢属真菌。作为本发明的一种实施方式，以待测样本的dna为模板，利用所述特异性引物对进行pcr扩增，检测pcr扩增产物；如果检测到特异性扩增产物，则待测样本为/候选为刺盘孢属真菌，或者，含有/疑似含有刺盘孢属真菌；如果未检测到特异性扩增产物，则待测样本不是/疑似不是刺盘孢属真菌，或者，不含/疑似不含刺盘孢属真菌。作为本发明的另一种实施方式，以待测样本的dna为模板，利用所述引物探针组合进行实时荧光pcr扩增，检测荧光信号，如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线，则待测样本为或候选为刺盘孢属真菌，或者，含有或疑似含有刺盘孢属真菌；如果荧光信号显示不符合阳性扩增曲线，则待测样本不是/疑似不是刺盘孢属真菌，或者，不含/疑似不含刺盘孢属真菌。以上任一所述特异扩增产物可为69bp的扩增产物。优选地，所述pcr扩增的反应体系中，所述特异性引物对的浓度为0.4～0.9μm，所述 [[ 探针 ]] 的浓度为0.3～0.9μm。采用上述引物和探针的浓度，能够更好地提高pcr扩增反应的扩增效率，进而提高检测的特异性、灵敏度和准确性。优选地，所述实时荧光pcr的反应条件为：95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。本发明中，所述待测样本可为植物样品、真菌纯培养样品、土壤样品等。

优选地，所述植物样本具体可为叶片、茎秆、根、 [[ 果实 ]] 等。本发明进一步优化了实时荧光pcr的反应体系，获得了最优的引物浓度和探针浓度。本发明针对现有技术中依赖形态学检测和测序对刺盘孢属真菌进行鉴定的方法存在的技术问题(费时、繁琐、专业性要求高等缺点)，根据刺盘孢属物种的遗传学和分子生物学特征，开发了刺盘孢属保守的、属特异性靶序列以及其特异性引物对和探针，利用开发的特异性引物对和探针对刺盘孢属真菌进行检测鉴定，进而提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的鉴定刺盘孢属真菌的方法。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)高普适性：对比现有技术适于特定的一种刺盘孢属真菌，本发明对多种刺盘孢属真菌具有高度的普适性，包括如表1所示的50余种重要的刺盘孢真菌(colletotrichum＝c.)；表1本发明适用的刺盘孢属真菌(2)检测过程快速简单：本发明提供的检测方法仅需少量dna样品，利用荧光pcr仪仅需1小时就可完成pcr扩增，直接得到检测结果；(3)特异性强：本发明提供的针对刺盘孢属真菌的特异性引物对具有高度的属特异性，能够高效进行目标基因片段的扩增，可与本发明提供的特异性荧光探针配合进行检测，有效地避免假阳性和假阴性；(4)灵敏度高：本发明提供的针对刺盘孢属真菌的特异性引物对具有优异的扩增效率，与本发明提供的特异性荧光探针配合，能够显著提高检测的灵敏度；(5)交叉污染低：本发明提供的荧光定量pcr检测方法的整个检测过程完全闭管，不需pcr后处理，消除了pcr产物的 [[ 污染 ]] ；(6)本发明提供的荧光定量pcr检测方法可以实现刺盘孢属真菌的定量检测。本发明提供的靶序列、特异性引物对和探针以及检测方法，在检疫口岸，能够对含有刺盘孢属真菌的样品进行快速准确筛查，防止病菌随种子及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延，对于植物病原性刺盘孢属真菌的检测、防控以及促进农业生产的健康发展具有重要的意义，具有重大的应用推广价值。附图说明图1为实施例2中不同引物浓度的扩增曲线对比图，其中，编号1～10分别为实验组1～10，编号0为空白对照组。图2为实施例3中不同探针浓度的扩增曲线对比图，其中，编号1～10分别为实验组1～10，编号0为空白对照组。图3为实施例4中实时荧光pcr检测刺盘孢属真菌的特异性分析结果图。

图4为实施例5中用于灵敏度分析的不同模板dna含量的扩增曲线对比图，其中，编号1～6分别为实验组1～6(3个重复)的扩增曲线。图5为实施例5中dna模板浓度与荧光定量检测的ct值呈负相关结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、 [[ 试剂 ]] 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所有涉及的菌株，均可以从商业途径或保藏机构获得。实施例1鉴定刺盘孢属真菌的靶序列、特异性引物和探针的筛选和确定从ncbi数据库获取刺盘孢属、同科不同属以及其它常见真菌(如：diaporthe、curvularia、fusarium等，见表2)的28srdna、its、gapdh等序列，结合申请人测序得到的刺盘孢属真菌以及其它真菌的大量序列，进行序列比对和分析，寻找在多种不同的刺盘孢属真菌中具有高度保守性、同时在与刺盘孢属亲缘关系较近的其它属真菌存在明显差异的序列，经筛选，确定普遍适用于刺盘孢属真菌鉴定的且具有属特异性的靶序列，其位于28srdna上，对应genbank登录号jn940819第310-378位的位置，当目标菌株为c.truncatumcbs151.35时，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.4所示，当目标菌株为c.cliviaecgmcc3.17358时，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.5所示。针对该保守区域设计多条特异性引物和探针，筛选并确定具有优异的靶序列结合和扩增效率、高度特异性和灵敏度的特异性引物和探针。