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在1970年代之前，由於無法從復雜的生物體中分離和研究單個基因而嚴重阻礙了對遺傳學和分子生物學的理解。 隨著分子克隆方法的出現，這種情況發生了巨大變化。[[微生物]]學家試圖了解細菌限制 [[ 細菌 ]] 噬菌體生長的分子機制，即分離的限制性核酸內切酶 ，這些酶只有在遇到特定的DNA序列時才能切割DNA分子。他們表明限制酶在特定位置切割了染色體長度的DNA分子，並且較大分子的特定部分可以通過大小分級純化。 使用第二種酶DNA 連接酶 ，可以將限制酶產生的片段連接到稱為重組DNA的新組合中。

通過將目標DNA片段與在細菌內部自然複製的載體DNA（例如噬菌體或質粒）重組，可以在細菌培養物中產生大量純化的重組DNA分子。1972年產生並研究了第一個重組DNA分子。<ref>[https://en.m.wikipedia.org/wiki/Molecular_cloning 體外生物功能細菌質粒的構建] [[ 美國 ]] 國家科學院學報</ref> <ref>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC389671/ 將新的遺傳信息插入猿猴病毒40的DNA的生化方法：含有λ噬菌體基因和大腸桿菌半乳糖操縱子的圓形SV40 DNA分子]美國國家科學院學報</ref>

分子克隆利用了以下事實： DNA在所有活生物體中的化學結構基本相同。 因此，如果將來自任何生物的DNA的任何片段插入到包含DNA複製所需分子序列的DNA片段中，並將所得的重組DNA引入獲得複制序列的生物中，則外源DNA將被複製以及轉 [[ 基因 ]] 生物中宿主細胞的DNA。

分子克隆與[[聚合酶鏈反應]]（[[PCR]]）相似，因為它允許複製DNA序列。 兩種方法之間的根本區別在於，分子克隆涉及在活微生物中復制DNA，而PCR在沒有活細胞的體外溶液中 復制DNA 複製DNA 。

* （1）選擇宿主生物和克隆載體 ，。* （2）製備載體DNA ，。* （3）製備要克隆的DNA ，。* （4）創建DNA的重組 ，。* （5）將重組DNA引入宿主生物 ，。

值得注意的是，DNA合成平台的能力和保真度不斷提高，使得分子工程學中的設計越來越複雜。 這些項目可能包括很長的新DNA序列鍊和/或同時測試整個文庫，而不是單個序列。 這些變化帶來了複雜性，要求設計從基於平面 [[ 核苷酸 ]] 的表示形式向更高的抽像水平轉變。 此類工具的示例包括GenoCAD ，Teselagen 或GeneticConstructor（學術界免費）。

儘管使用了大量的宿主生物和分子克隆載體，但絕大多數分子克隆實驗始於實驗室細菌 [[ 大腸桿菌 ]] （大腸桿菌）和質粒克隆載體 。大腸桿菌和質粒載體之所以被普遍使用，是因為它們在技術上很先進，用途廣泛，用途廣泛，並且只需最少的設備即可快速生長重組生物。如果要克隆的DNA非常大（數十萬至數百萬個鹼基對），那麼通常會選擇細菌人工染色體或[[酵母]]人工[[染色體]]載體。

專門的應用程序可能需要專門的宿主向量系統。例如，如果實驗者希望從重組生物中收穫特定蛋白質，則選擇表達載體 ，其包含用於在所需宿主生物中轉錄和翻譯的適當信號。或者，如果需要在不同物種中 復制DNA 複製DNA （例如，將DNA從[[細菌]]轉移到[[植物]]中），則可以選擇多個宿主範圍的載體（也稱為[[穿梭載體]] ）。然而，實際上，專門的分子克隆實驗通常始於克隆到細菌質粒中，然後再亞克隆到專門的載體中。

用限制性核酸內切酶處理克隆載體，以在將要插入外源DNA的位點切割DNA。 選擇限制酶以在切割位點產生與外源DNA的末端相容的構型（參見DNA末端 ）。 通常，這通過用相同的限制酶例如EcoRI切割載體DNA和外源DNA來完成。 大多數現代載體都包含各種方便的切割位點，這些位點在載體分子內是唯一的（因此，該載體只能在單個位點上被切割），並且位於一個基因（通常是β-半 [[ 乳糖苷酶 ]] ）中，其失活可以用來區分從非重組生物體中重組而來。 為了提高重組生物與非重組生物的比例，可以使用使載體末端去磷酸化的酶（ 鹼性磷酸酶 ）處理裂解的載體。 具有去磷酸化末端的載體分子無法複製，並且只有在將外源DNA整合到切割位點的情況下才能恢復複製。

用於克隆實驗的DNA也可以使用逆轉錄酶（ 互補DNA或cDNA克隆）從RNA中獲得，或以合成DNA的形式（ 人工基因合成 ）獲得。 cDNA克隆通常用於獲得代表目的細胞mRNA種群的克隆，而合成DNA用於獲得設計者定義的任何精確序列。 當跨遺傳密碼 （ - 例如，從線粒體到 [[ 細胞核 ]] ）移動基因時，或者僅通過密碼子優化來增加表達時，可能需要這種設計的序列。<ref>[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3074964/ 同義詞但不相同：密碼子偏倚的原因和後果]自然評論遺傳學</ref>

在許多方面，重組DNA的產生是分子克隆過程中最簡單的步驟。 從載體和外源製備的DNA可以簡單地以適當的濃度混合在一起，並暴露於將末端共價連接在一起的酶（ DNA連接酶 ）中。 這種連接反應通常稱為連接 。 然後準備將包含隨機連接末端的所得DNA混合物引入宿主生物中。

電穿孔使用高壓電脈衝使DNA跨 [[ 細胞膜 （ ]]'''[''' 和細胞壁（如果存在） ） ''']''' 轉移。相反， 轉導涉及將DNA包裝到病毒衍生的顆粒中，並使用這些病毒樣顆粒通過類似於病毒感染的過程將封裝的DNA引入細胞。 儘管電穿孔和轉導是高度專業化的方法，但它們可能是將DNA移入 [[ 細胞 ]] 的最有效方法。

在分子克隆實驗中獲得的單個克隆的總種群通常被稱為DNA文庫 。 庫可能非常複雜（如從生物體中克隆完整的基因組DNA）或相對簡單（如將先前克隆的DNA片段移入其他質粒時），但是幾乎總是需要檢查許多不同的克隆以確保獲得所需的DNA構建體。 這可以通過非常廣泛的實驗方法來完成，包括使用核酸雜交 ， 抗體探針 ， 聚合酶鏈反應 ， 限制性片段分析和/或DNA測序 。

在單個基因的水平上，分子克隆被用於生成探針 ，用於檢測基因的表達方式 ，以及該表達方式與生物學中的其他過程（包括代謝環境，細胞外信號，發育，學習，衰老和細胞死亡。 克隆的基因還可以通過允許研究人員使基因失活或使用區域誘變或定點誘變進行更細微的突變，從而提供工具來檢查單個基因的生物學功能和重要性。 克隆到表達載體中進行功能克隆的基因提供了一種根據表達的蛋白質功能篩選基因的方法。

獲得基因的分子克隆可以導致產生被克隆的基因的蛋白質產物的生物的發展，所述蛋白質產物被稱為重組蛋白。 在實踐中，與克隆基因相比，開發出可產生所需數量的活性形式的重組蛋白的生物通常更加困難。 這是因為用於基因表達的分子信號是複雜且可變的，並且因為蛋白質折疊，穩定性和運輸可能非常具有挑戰性。

基因治療涉及向缺乏該功能的細胞提供功能基因，目的是糾正遺傳性疾病或獲得性疾病。 基因治療大致可分為兩類。 首先是生殖細胞的變化，即精子或卵子的變化，導致整個生物體及其後代的永久性遺傳變化。 許多人認為這種“生殖系基因療法”在人類中是不道德的。第二種基因療法，即“體細胞基因療法”，類似於器官移植。 在這種情況下，通過直接治療或通過去除組織，在實驗室中添加一種或多種治療基因，以及將治療後的細胞返回給患者來靶向一種或多種特定組織。 體細胞基因療法的臨床試驗始於1990年代後期，主要用於 [[ 癌症 ]] ， [[ 血液 ]] ， [[ 肝臟 ]] 和 [[ 肺 ]] 部疾病的治療。