包涵體

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包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區，與胞質中其他成分有明顯區別。

包涵體形成是比較複雜的，與胞質內蛋白質生成速率有關，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行摺疊，從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體；此外，包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養條件，如培養基成分、溫度、pH值、離子強度等因素有關。

細胞中的生物學活性蛋白質常以可溶性或分子複合物的形式存在，功能性的蛋白質總是摺疊成特定的三維結構型。包涵體內的蛋白是非摺疊狀態的聚集體，不具有生物學活性。

目錄

定義

基因工程定義：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們緻密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。

病毒在增殖的過程中，常使寄主細胞內形成一種蛋白質性質的病變結構，在光學顯微鏡下可見。多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆粒或尚未裝配的病毒亞基聚集而成；少數則是宿主細胞對病毒感染的反應產物，不含病毒粒子。有的位於細胞質中（如天花病毒包涵體），有的位於細胞核中（如皰疹病毒），或細胞質、細胞核中都有（如麻疹病毒）。有的還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內基氏（Negri）小體。

簡介

與一般微生物細胞相比，基因工程菌的細胞破碎要複雜得多。基因工程菌新合成的重組蛋白，是沒有活性的、摺疊構型有誤的蛋白質，叫包涵體。細胞破碎後先分離出包涵體，將包涵體溶解在變性劑中。再加入還原劑，還原蛋白質中的半胱氨酸，使二硫鍵斷裂，得到單體肽鏈再復性重新摺疊。

特性

一般含有50%以上的重組蛋白，其餘為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶於水，只溶於變性劑如尿素、鹽酸胍等。

形成

主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質摺疊的輔助因子或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。

1、表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行摺疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。

2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關。

3、重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。

4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由於缺乏真核生物中翻譯後修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉澱。因此有人採用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

在基因重組技術得到迅速發展之前，研究者就已經發現，細胞內人工引入反常的蛋白質（這些蛋白質可以看作是細胞的外源蛋白質），這些蛋白質會堆積起來形成不溶的形式。這些蛋白質聚集的形態是明顯的球形，這些球形的物質全部是蛋白質，並且通過非共價鍵的作用力形成，必須使用變性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或者鹽酸胍才能溶解。自從基因工程的蛋白質在大腸桿菌表達以後，人們逐漸發現這些外源蛋白質基因在細胞中的過量表達同樣形成不溶性的狀態。

Georgiou等人發現天然的蛋白質在大腸桿菌中大量表達時，如內酰氨酶和鹼性磷酸酶的過量表達，都形成了包涵體，前者的包涵體在外周質，後者的包涵體存在於細胞質中。其它的宿主細胞中也發現了重組蛋白質過量表達時形成的包涵體或者聚集體，如細菌病毒、哺乳動物細胞中。

包涵體在一些外界壓力下也可以形成，如溫度，是影響包涵體形成與否的主要因素。有些蛋白質在高溫的情況下容易形成包涵體，這是由於這些蛋白質在高溫下容易變性而形成聚集體。所以有人認為，當蛋白質具有高的融化溫度、高的天然構象穩定性的情況下，包涵體就不容易形成。但是，對一些體內包涵體形成的研究發現，包涵體的形成先於成熟肽鏈的形成，或者是同時進行的。在研究P22尾刺蛋白質發現，儘管尾刺蛋白質有高的穩定性，結構中主要是片斷，融化的溫度是88℃，並不受SDS、蛋白質酶和熱失活的作用，但是這種蛋白質是為數不多的在細胞內形成包涵體的原核蛋白質模型。有些天然的蛋白質在高溫（39.1℃）表達時可以提高25%，但是這些蛋白質不能摺疊成天然的狀態而形成聚集體。聚集體形成的動力學表明，這些聚集體是從部分摺疊的中間體形成的。實際上，這些摺疊的中間體或者形成天然的狀態，或者形成聚集體，這個過程是溫度依賴性的，溫度的升高利於聚集體的形成。當蛋白質肽鏈在高溫下表達，合成的肽鏈足夠早地轉移到低溫下時，這些蛋白質肽鏈會重新進入摺疊的過程。同時，當尾刺蛋白質在允許的溫度下表達後，再把細胞轉移到高溫下，這些蛋白質肽鏈保持活性，證明了一旦蛋白質被正確的表達並摺疊成正確的構象以後，則細胞內的蛋白質的穩定性和溶解性在高溫下不再改變。蛋白質在體內摺疊的中間體對於溫度因子明顯敏感。

沙眼衣原體包涵體認為較高的溫度可能增加了蛋白質合成的速度、摺疊中間體形成聚集體的速度以及疏水相互作用力，表達的蛋白質易於以包涵體的形式存在。

其它的發酵條件同樣影響蛋白質包涵體的形成，發酵液中加入蔗糖可以大大降低內酰胺酶包涵體的形成。蔗糖的作用可能是穩定天然蛋白質的結構或者防止蛋白質摺疊中間體的聚集。在體外的內酰胺酶摺疊復性的過程中，同樣發現復性緩衝液中加入蔗糖可以提高蛋白質的復性率。其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白質的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。也有報道認為在豐富的培養基中有利於活性蛋白質的表達，當培養條件不佳時如供氧不足或pH控制不佳時易形成包涵體。

蛋白質的聚集體和包涵體不僅僅存在於重組蛋白質的表達中，是一個廣泛存在的現象。通常認為，蛋白質的聚集現象，無論細胞內還是細胞外，都是中間體不能完成摺疊而形成自我聚集現象。包涵體的形成與多肽鏈的序列、表達速度、可用的伴侶分子的量以及生長的環境有關。

特點

包涵體是新合成的肽鏈在摺疊過程中部分摺疊的中間體形成的，而不是由完全的解摺疊形式的蛋白質形成的，這可能與體外復性時聚集體的形成有相似的機制，

包涵體熒光圖

應該考慮到在包涵體中含有這些部分摺疊的結構。但是，由於包涵體的特性，很難利用物理的方法去探測包涵體中蛋白質肽鏈的結構。Zetlmeissl等人利用圓二色的方法，發現聚集體的肽鏈保持了部分的二級結構。利用Raman測定的方法也得出了相同的結論。利用ATR-FTIR發現包涵體蛋白質的結構比天然的蛋白質和鹽沉澱的蛋白質含有更多的非天然狀態的摺疊的結構。Murry等人利用免疫學的方法測定色氨酸合成酶的亞基，蛋白質復性以後，出現三種形式的蛋白質：一種是不溶的高分子量的聚集體，一種是可溶的復性完全的蛋白質，一種是可溶的低分子量的聚集體，最後一種聚集體同天然的蛋白質一樣有免疫活性，可以與兩種單克隆抗體結合，但是天然蛋白質的另外三種抗體不與它結合，說明了即使沒有復性，聚集體仍保持了部分的近似天然的結構狀態。

在大腸桿菌中，包涵體可以在細胞的兩個位置出現：細胞質和外周胞質。包涵體在細胞內形成的位置和特點取決於蛋白質表達的方式。三種表達的內酰氨酶，一種是天然的內酰氨酶，一種是含有OmpA信號肽，一種完全切除了天然蛋白質的信號肽，當大量表達時，造成了聚集體的形成，前兩者的聚集體在外周胞質，後者在細胞質內形成聚集。這些包涵體在大小和形狀有相當清楚的差別，這些差別表現了聚集體的表面形態、組成和形成聚集體的多肽鏈構象上的不同。

大腸桿菌細胞質中的包涵體直徑一般在0.2到1.5μm之間，不同的蛋白質具有不同的直徑，如干擾素的大小是0.811μm，而牛凝乳酶原的大小是1.281μm。大的包涵體可以利用光學顯微鏡看得到。在一些情況下，有些包涵體比較大，直徑大於大腸桿菌的直徑，使得大腸桿菌有一個突起。一般情況下，一個細胞僅有一個包涵體。包涵體從來不吸附在膜上，並且不同於真核細胞中的其它的細胞器。高精度的投射電子顯微鏡顯示了多孔的結構。

所有的包涵體密度較大，是微生物細胞中密度最大的結構，密度在1.1-1.3之間，不同蛋白質的包涵體的密度也不同，一些低分子量的包涵體結構是多孔的。

聚集體的構象還沒有進行系統的研究，但是已經知道聚集在一起的作用力不是共價鍵，主要的是疏水相互作用力。大腸桿菌的細胞質中有大量的穀胱甘肽，抑制二硫鍵的形成。所以，當蛋白質在細胞質中表達時，由於形成不了二硫鍵而形成了聚集體。內酰氨酶的包涵體進行蔗糖梯度離心表明其中95%是蛋白質成分，說明很少有其他的蛋白質成分加入到聚集體中，利用免疫學的方法，也沒有發現伴侶分子。體內聚集體的形成不僅產生包涵體，而且會帶來澱粉質的疾病，對哺乳動物同樣會造成疾病。

對體內或者體外蛋白質聚集體形成的研究，特別是了解氨基酸序列如何避免聚集體的形成，可以大大提高蛋白質在體外摺疊的收率，並且有助於理解體內分子病形成的機制。

病毒包涵體

包涵體有的位於細胞質中（如天花病毒包涵體）。

有的包涵體還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內基氏（Vegri）小體。

溶解

維持包涵體內蛋白質結構的作用力是分子內的作用力，這種作用力也維持天然蛋白質的穩定性的結構。先前有報道這種作用力是共價鍵結合的，但是，趨向於一致，就是維持包涵體內部的蛋白質的緊密的結構的是非共價鍵的作用力。二硫鍵，無論是正確的還是錯誤的二硫鍵，在維持內部蛋白質的緊密的結構中都沒有發揮直接的作用。最經常的獲得活性蛋白質的第一步是溶解這些包涵體蛋白質，溶解液是使這些包涵體蛋白質完全變性的成分，當蛋白質被溶解以後，則進入到蛋白質的體外摺疊的過程。

視頻

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