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| 皮肤干细跑 | |
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皮肤干细跑，是人体最大的器官，它被覆于身体表面，由表皮、真皮、皮下组织及附属器组成。在抵御微生物入侵、紫外线辐射以及防止水分的丢失、调节体温和维持人的外貌等方面起着十分重要的作用。
皮肤有极强的修复和再生能力，这与皮肤干细胞的存在具有直接的关系。虽然目前对皮肤干细胞的位置、种类和数量报道不一，但研究较多的主要有表皮干细胞(Epidermal stem cells)和毛囊干细胞(follilar stem cells)。[1]
基本介绍
表皮干细胞是各种表皮细胞的祖细胞,来源于胚胎的外胚层,具有双向分化的能力。一方面可向下迁移分化为表皮基底层,进而生成毛囊;另一方面则可向上迁移,并最终分化为各种表皮细胞。
表皮干细胞在胎儿时期主要集中于初级表皮嵴,至成人时呈片状分布在表皮基底层。表皮干细胞在组织结构中位置相对稳定,一般是位于毛囊隆突部皮脂腺开口处与竖毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘。
表皮干细胞与定向祖细胞在表皮基底层呈片状分布，在没有毛发的部位如手掌、脚掌，表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层;在有毛发的皮肤，表皮干细胞则位于表皮基部的基底层。其中有1%~10%的基底细胞为干细胞。[2]
不同发育阶段的人皮肤表皮干细胞的含量不同。胎儿期表皮基底层增殖细胞均为表皮干细胞和短暂扩增细胞，而少儿表皮基底层中部分细胞为表皮干细胞和暂时扩增细胞，成人表皮干细胞和暂时扩增细胞所占比例则进一步降低。
相关细胞
毛囊是皮肤附属物之一，多位于真皮。由于最初在毛球部发现有显著的细胞分裂，因而早期人们认为毛球是细胞分裂及毛囊生长期起始的重要部位。1990年，Cotsarelis等对小鼠皮肤进行HTdR掺入实验，4 周后发现毛母质细胞不含有标记而95 %以上的毛囊隆突部细胞仍保持标记。
同时形态学上看，隆突细胞体积小，有卷曲核，透射电镜检查发现其胞浆充满核糖体,而且缺乏聚集的角蛋白丝，细胞表面有大量微绒毛，是典型的未分化或"原始状"细胞。因而提出了毛囊干细胞定位于隆突部。随后的多个实验进一步支持了毛囊干细胞定位于隆突部的理论。
(二)皮肤干细胞的生物学特性
表皮干细胞最显著的是慢周期性(slow cycling)、自我更新能力以及对基底膜的粘附。
①慢周期性在体内表现为标记滞留细胞(label-retaining cell)的存在，即在新生动物细胞分裂活跃时参入氚标的胸苷，由于干细胞分裂缓慢，因而可长期探测到放射活性，如小鼠表皮干细胞的标记滞留可长达2年。表皮干细胞慢周期性的特点足以保证其较强的增殖潜能和减少DNA复制错误;
②表皮干细胞的自我更新能力表现为在离体培养时细胞呈克隆性生长，如连续传代培养，细胞可进行140次分裂，即可产生1×1040个子代细胞;
③对基底膜的黏附，其主要通过表达整合素来实现黏附过程，而且不同的整合素作为受体分子与基底膜各种成分相应的配体结合。
表皮干细胞对基底膜的黏附是维持其自身特性的基本条件，也是诱导干细胞脱离干细胞群落，进入分化周期的重要调控机制之一。此外，体外分离、纯化表皮干细胞也是利用干细胞对细胞外基质的黏附性来进行的。
毛囊干细胞最重要的特点之一也是慢周期性，而且可以有无限多次细胞周期。一个完整的毛囊周期要经过生长期、退化期和休止期。在毛囊生长期时，位于隆突部的细胞可快速增殖，产生基质细胞，进而分化出髓质、皮质和毛小皮等。
而后，毛基质细胞突然停止增殖，进入退化期。最后毛乳头被结缔组织鞘迁拉，定位于毛囊底部，在毛囊处于休止期时，通过毛乳头上移，使毛囊进入下一个循环。
尽管已经在皮肤表皮、毛囊中发现有干细胞的存在，但目前一些研究学者对确定皮肤干细胞的最终来源仍存在争议。
(三)皮肤干细胞的分离
皮肤干细胞的分离主要利用发现的相对特异的表面标志(如整合素家族成员和角蛋白家族成员)结合流式细胞术进行。
(四) 皮肤干细胞的鉴定
利用皮肤干细胞一些相对特异的标志建立了一系列的皮肤干细胞鉴别方法。最初，一些学者是从研究细胞黏附特性入手的。他们发现，在表皮基底细胞定向分化时，它会失去其对基底膜蛋白的黏附性，而这种黏附性是受细胞表面受体-整合素家族调控的。
整合素为异源双聚体，包括α和β两种亚基。在基底层细胞定向分化过程中，β1整合素表达下调，直至细胞完全脱离基底层，其细胞表面β1整合素才丧失表达，故β1整合素可作为表皮干细胞的一个表面标志。
表皮干细胞高度表达3 种整合素家族的因子:α2β1 、α3β1和α5β1。另外，β1整合素高表达也可作为毛囊干细胞的一个表面标志;
角蛋白(Keratins)是表皮细胞的结构蛋白,它们构成直径为10nm的微丝,在细胞内形成广泛的网状结构。随着分化程度的不同,表皮细胞表达不同的角蛋白，因而角蛋白也可作为干细胞、定向祖细胞以及分化细胞的鉴别手段。
表皮干细胞表达角蛋白19(K19)，定向祖细胞表达角蛋白5和14(K5和K14)，而分化的终末细胞则表达角蛋白1和10(K1和K10);有实验结合表皮干细胞表面的α6整合素及另一个与增殖有关的表面标志10G7，可以区分干细胞与定向祖细胞。
α6阳性而10G7阴性的细胞处于静息状态,在体外培养中具有很强的增殖潜能，认为是表皮干细胞。而α6与10G7均阳性的细胞是定向祖细胞，体外培养证实其增殖能力有限;有p63 (一种与p53 同源的转录因子)也可区分人类表皮干细胞和暂时扩大细胞。表皮干细胞分化为暂时放大细胞后p63 表达量迅速减少,连续培养的表皮干细胞可维持p63 分泌。
(五)皮肤干细胞的临床应用
皮肤干细胞的临床应用主要表现在几个方面:(1)在细胞替代治疗中的应用。当皮肤受到外伤、疾病等的损伤时，位于皮肤表皮基底层和毛囊隆突的皮肤干细胞就会在内外源因素的调控下，及时增殖分化生成相关细胞，以修复机体受损表皮、毛囊等结构。
特别是大面积Ⅲ度烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损，仅靠创面自身难以实现皮肤的再生,需要足够的皮肤替代物进行修复。这时可以进行自体皮肤细胞的培养并应用于创面覆盖。
培养的皮片在体外及移植于创面后均保持有正常表皮的自我更新能力,即保留了干细胞自我更新与分化潜能的特性。培养的表皮除用于自体移植外，还用于异体移植,如应用于慢性溃疡与Ⅱ度烧伤创面。直接利用皮肤干细胞进行组织原位修复。
(2)在组织工程中的应用。人工真皮是利用组织工程技术形成商品化用于临床的真皮替代物，它可诱发正常的皮肤愈合过程，已用于治疗大面积烧伤病人的暂时性皮肤覆盖及慢性皮肤溃疡的治疗。
(3)在基因治疗中的应用。干细胞因具有高度自我更新和多向分化潜能，因此一直为基因治疗首选的靶细胞。将表皮干细胞作为皮肤遗传性疾病等基因治疗的靶细胞已成为可能。将外源基因通过逆转录病毒导入表皮干细胞并植入体内后，机体可长期维持转导基因的表达，这就为表皮干细胞应用于基因治疗提供了可靠的依据。
基因治疗除可用于皮肤遗传性疾病治疗外，对于各种原因引起的皮肤肿瘤等也同样适用。如毛囊肿瘤，在了解其发生机制的基础上，通过导入肿瘤抑制基因阻断或抑制肿瘤发生过程，还可将耐药基因或造血生长因子基因导入正常毛囊干细胞或耐药细胞株，提高化疗耐受力。
转变
介绍
美国斯坦福大学医学院以转化开创性医学研究为病人提供优质护理而闻名。Dr. Zhiping(原分子和细胞生理学系博士后)和Dr. Ami Citri(精神病和行为学系博士后)结合他们的努力，与其他研究人员一道在Nature Protocols杂志上发表了题为Induction of human neuronal cells by defined transcription factors, Nature; and also Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells的文章。这篇文章和其他的相关操作流程描述了他们如何将干细胞和产后皮肤细胞转变成神经(脑)细胞的工作。Dr Pang 说:"这些工作不仅在利用细胞模型研究人类神经疾病方面迈出了重要的一步，而且也将对解读表观遗传学如何调控神经细胞的分化和成熟提供重要的参考。"
挑战
作者在文中测试了两种假设:1)确定强制性表达的转录因子是否可诱导人类多能干细胞获得神经元细胞特性，2)非神经元的人成纤维细胞是否也可被转换成神经元。Citri博士说:"zhiping来找我，他需要这个项目能够在单细胞水平上评估细胞群落中的多样性。"他说:"要评估转换成神经细胞的效率，成熟细胞的水平以及转化后获得特定的神经细胞的属性都是理解从其他细胞诱导成神经元细胞的基础。因此我们建立了一个流程，利用Fluidigm的动态整合微流体芯片来评估单个神经元。我们从一组相对大量的单细胞样品中，检测了一套胶质生物标记、神经元标记或成纤维细胞的标记物以评估神经元的转换过程的效率和特异性。我们从小鼠神经元细胞开始，尝试着检测从Fluidigm公司平台获得的数据的质量情况，但它的有效性立即让我们吃了一惊。"
Dr Zhiping Pang在编写这篇文章及本报告中提到的流程时是斯坦福大学医学院分子和细胞生理学系博士后。他是新泽西州儿童健康研究所和罗伯特·伍德·约翰逊医学院的神经科学和细胞生物学系助理教授。他的工作重点是研究肥胖症。
Dr Ami Citri博士是在斯坦福大学的精神病学和行为科学系做博士后的时候进的行这项研究。 2012年夏天，他将担任耶路撒冷的希伯来大学的高级讲师(助理教授)。他的工作重点是在成瘾症的研究。
Dr Citri 认为:"Fluidigm的方法效力非常巨大，我几乎不会再回头去使用传统的定量PCR方法了。"
解决方案
在他们的第一个实验中，为了确定在人类多能干细胞中表达转录因子是否可诱导神经元的属性，在未分化的人类胚胎干细胞(ES)中转染了Brn2，ASCL1和myt1l(作者称为"BAM")与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。经过处理后，他们观察到双极类神经细胞及成熟的神经元形态，并表达典型的神经元细胞TUBB3和MAP2蛋白。电生理分析显示，这些细胞产生了动作电位。因此BAM因素可在人类干细胞中诱导出神经细胞的的差异。在他们的第二个实验中，他们想了解非神经元人成纤维细胞是否也可以被直接转换成神经元。他们用BAM因素+ NEUROD1转染初级人类胎儿成纤维细胞系(HFFs)。这些因素可产生成熟的神经元细胞，表达神经丝蛋白，及体现神经元的一些表征过程，包括具有synapsin and synaptotagmin(两个突触囊泡蛋白)染色阳性。因此，BAM+NEUROD1因素可诱导非神经元人成纤维细胞的神经细胞分化。
方法
使用Fluidigm公司的48.48动态芯片进行单细胞基因表达分析。通过簇电极(patch electrodes)抽取收集生长在培养皿中的单细胞，并喷出到CellsDirect™缓冲液(Invitrogen)中，然后快速冷冻直到下一步工序。解冻的细胞进行特定目标的逆转录和18个循环的PCR进行预扩增(STA)。 预扩增产物在BioMark系统上进行实时PCR分析。为确保特异性的扩增，在每个实验中包含梯度滴定的人脑总RNA，并只对表现出线性扩增的引物进行分析。此外，对单细胞和对照RNA的PCR产物熔解曲线进行比较，以确保PCR产物的特异性。BioMark系统为验证免疫荧光和电生理的表型数据提供了另一层面的数据。这些研究人员在Nature protocols杂志上发布了他们的实验路程:Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells。Dr Pang说:"当人们谈论以传统的方式做单细胞PCR时，我从来没有留下深刻的印象。这是低通量的，他们不能运行验证测试。但有了Fluidigm公司的技术，我们可以使有多个内部对照，我们可以确定一个实验是否能工作。该系统给了我们完美的结果。真正让我感到惊讶的是，当我们重复了其中一个芯片的实验，我们得到几乎相同的结果，所以它是高度可重复的。我们认为，在神经科学界的其他人可能有兴趣做这方面的工作。因此，我们写了这个操作流程的文章并被杂志接受。"
技术优势
虽然这些研究人员主要使用的的BioMark系统进行神经元的研究，他们说，他们相信其他领域的研究也可以受益于这项技术。 "任何需要进行细胞群落在单细胞水平的多样性的研究、及任何受起始原料限制的领域，这都将是富鲁达技术发挥巨大效应的地方。"Citri博士说。"这可以是人的活组织切片检查，或因为器官太小而从少量的组织中开始首次实验，也可以是任何应用激光捕获的显微切割样品，或提取的一个非常明确的细胞群体。"
Dr Pang说:"单细胞基因表达分析适用于许多领域，包括细胞生物学和神经学。当有异质性的细胞群，细胞特异性基因转录的识别就变得非常重要。"在这个研究之后，这两个科学家已经接受了在各自新的研究机构的学术职位，但他们都打算继续使用富鲁达的平台进行单细胞的研究。
"Fluidigm的方法效力是如此的巨大，我几乎不会再回头去使用传统标准的定量PCR方法。"Dr. Citri说。"这是非常有用的，因为它让我用高效率和低成本的方式验证微芯片(microarray)数据。当我在各种应用中检测大量的基因时，我不需要每次用微芯片来处理样品。我可以用富鲁达公司的微流体芯片用数百个探针研究很多样本。从原始的微芯片实验中我已经创建了一个候选基因和定量PCR探针数据库。此外，有效地利用最小的样品量，可以让我把我的样品作成一个文库，每当一组新的基因成为我的兴趣焦点时我可以不断对他们进行检测。对我来说，这是Fluidigm公司系统的巨大优势之一。"
Dr Pang在2011年11月开始在新泽西州儿童健康研究所和罗伯特·伍德·约翰逊医学院的神经科学和细胞生物学系担任助理教授进行独立科研工作。
"我实验室的研究重点是:研究从干细胞到大脑的突触调节机制。我有兴趣了解肥胖人的食物摄入行为是如何被身体的激素和神经肽改变的。"他说， "一个有趣的现象是，在下丘脑区域有一组神经元表达瘦素(leptin)受体，但它们对瘦素的反应有很大差异。我推断下丘脑不同的细胞有不同的基因表达模式，这些只能用单细胞基因表达谱来解析。我的另一个研究方向是用人的成纤维细胞或多能性干细胞诱导成神经细胞，用这作为细胞模型来研究人类神经系统疾病。单细胞的基因分析将是在我的实验室中研究这些突触调控会使用的主要技术之一。"