密度梯度离心法查看源代码讨论查看历史
| 密度梯度离心法 |
密度梯度离心法: 液体在离心时，其密度随转轴距离而增加。碱基GC 配对的双链DNA 片段密度较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA 按密度大小分布开来。进而通过与某种放射性标记的mRNA 杂交来检验，分离相应的基因。非洲爪蟾rDNA.5sDNA 和海胆组蛋白基因就是这样分离得到的。密度梯度超离心技术不仅可以分离细胞中的DNA,也可以利用它分离到生物细胞中的某些目的基因的mRNA。一般细胞含mRNA 并不丰富，大多数细胞mRNA 只占总RNA 百分之几，mRNA 种类又非常多，各种mRNA 链长短不一，总mRNA 提取出来后，提取到铺在已预制了不同密度层次溶液介质的离心管中，人们可以利用密度梯度超离心技术将大小不同的mRNA 分离在不同密度层次上，然后可以根据所需的mRNA 的大小，在相应层次上提取。
密度梯度区带离心法(简称区带离心法)，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是:①分离效果好，可一次获得较纯颗粒;②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒;③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是:①离心时间较长;②需要制备惰性梯度介质溶液;③操作严格，不易掌握。
基本信息
中文名称； 密度梯度离心法
外文名称； density gradient centrifugation method
简称； 区带离心法
又称； 平衡密度梯度离心法
属性； 分离方法
密度梯度离心法
英文名称: density gradient centrifugation method
〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在离心力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。自1958年米西尔逊(M.Meselson)，斯塔尔(F.W.Stahl)，维诺格拉德(J.Vinograd)成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与〔1〕不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。
折叠编辑本段工作原理 又称速率-区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法;
原理:不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油;
密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。
主要应用
可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。
操作
纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。其过程如下:
1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。
2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。
4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。
5、去蔗糖;用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE(根据沉淀的量决定加入多少)缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。
注意事项
离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带。再通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带中的颗粒分开收集，得到所需的物质。
1、梯度介质应具备足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围。
2、梯度介质不会与样品中的组分发生反应。
3、梯度介质也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。
4、若离心时间过长由于颗粒的扩散作用，会使区带越来越宽。为此，应适当增大离心力、缩短离心时间，可以减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。[1]