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反轉錄酶

[1]來自 搜狗 的圖片

反轉錄酶(reverse transcriptase,也可寫成逆轉錄酶) 又稱為依賴RNA 的DNA 聚合酶。1970 年Temin 等在致癌RNA 病毒中發現了一種特殊的DNA 聚合酶，該酶以RNA 為模板，以dNTP 為底物，tRNA( 主要是色氨酸tRNA) 為引物，在tRNA 3'-OH 末端上，根據鹼基配對的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA 模板互補的DNA 單鏈，這條DNA 單鏈叫做互補DNA (complementary DNA，CDNA)。

反轉錄酶（Reverse transcriptase）是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉錄酶和鼠類B型病毒的反轉錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉錄酶則由兩上亞基結構。真核生物中也都分離出具有不同結構的反轉錄酶。

簡介

多反轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性 。

①RNA指導的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高 。

②RNase H活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNase H從RNA5′端水解掉RNA分子 。

③DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。

除此之外，有些反轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。反轉錄酶的發現對於遺傳工程技術起了很大的推動作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA並以它為模板，在反轉錄酶的作用下，合成出互補的DNA(cDNA)，由此可構建出cDNA文庫(cDNa library)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術中最常用的獲得目的基因的方法

實例

這是一種莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反轉錄酶(簡稱M-MLVRTase)，

這個酶已經作了遺傳性上的改變，即除去了與它聯在一起的核糖核酸酶H活性(一種專門切割DNA與RNA雜交鏈上RNA分子的酶)。這個酶應用於cDNA的第一鏈合成和引物的延伸。這種酶需要鎂離子或錳離子作為輔助因子，當以mRNA為模板時，先合成單鏈DNA（ssDNA），再在反轉錄酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以單鏈DNA為模板合成「髮夾」型的雙鏈DNA（dsDNA），再由核酸酶S1切成二條單鏈的雙鏈DNA。因此，反轉錄酶可用來把任何基因的mRNA反轉錄成cDNA拷貝，然後可大量擴增插入載體後的cDNA。也可用來標記cDNA作為放射性的分子探針。

逆轉錄酶（M-MLV）從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來，可用於合成第一鏈cDNA、製作cDNA探針、RNA轉錄、測序和RNA的逆轉錄反應。本酶是通過點突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同，同時其延伸能力也有顯著提高。逆轉錄酶（M-MLV）一個活性單位定義為在37℃，10min條件下，使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉澱物質所需的酶量。

使用說明

M-MLV反轉錄酶比AMV反轉錄酶缺乏連續性，因此要獲得像AMV反轉錄酶反應中產生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉錄酶。用1微克的mRNA起始合成第一條鏈的cDNA，要用8單位的M-MLV反轉錄酶才相當於1單位的AMV反轉錄酶的作用。

該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制，該酶絕對不能用Promega的RiboprobeAMV反轉錄酶5X反應緩衝液，也不能用Promega的RiboclonecDNA第一條鏈緩衝液，因為這二種緩衝液均含有亞精胺。

注意事項

反轉錄酶

在進行RT反應之前，應考慮以下幾個方面：

1、RNA

成功的cDNA合成來自高質量的RNA，高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中，要特別防止RNase的污染，同時在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈cDNA合成反應中，在緩衝液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA，B，C對RNA的降解，並不能防止皮膚上的RNase，因此儘管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實驗過程中經常更換新手套。

2、引物的選擇

OligodT

選擇OligodT時，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，所以對RNA樣品的質量要求較高，最好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。

隨機引物

適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第一鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然後進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關係，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（<500bp）的增加和長片斷、全長產物產物的降低。

特異性引物

特異性引物只能用你設計引物時的下游引物做RT，引物設計質量影響RT的結果，而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以按照說明書按照一個溫度做不是最佳選擇，一般不推薦。