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反义基因表达载体

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反义核酸技术是人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。此技术已成为基因治疗的重要手段，其中构建反义表达载体就可以在靶细胞内直接产生致病基因的反义RNA片段。将获得的致病基因反向组入表达载体，即可构建成反义表达载体。当反义表达载体导入靶细胞后，就可转录出与致病基因mRNA互补的反义RNA，特异性地封闭致病基因的表达。

几种特殊用途的克隆载体

启动子探针载体

启动子是调控基因有效转录的必备元件，是构建基因表达载体的重要组成部分，在研究生物发育机制、提高目的基因表达产量和进行基因治疗等方面起着重要的作用。分离不同类型基因启动子已成为基因工程的重要任务之一，而启动子探针(promoter probe)载体则是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具。启动子探针载体除了质粒载体必备的元件外，还必须含有检测部件。检测部件有两部分组成，即一个已失去启动子且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。用作检测遗传标记基因主要有抗生素抗性基因和绿色荧光蛋白基因新，等。

诱导型表达载体

诱导型表达载体指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。外源基因处于这样的启动子下，必须在合适的诱导条件下才能表达。采用这种表达载体获得的转基因生物便于人工控制，即使进入自然环境中，由于不存在合适的诱导条件，因此不能表达外源基因产物，也不会导致环境污染和影响生态系统的平衡。可以认为这是一类较安全的基因表达载体，并且鉴于诱导表达载体能人为地控制基因时空的表达，将为基因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段。用作诱导型的启动子有二价金属离子诱导启动子、红光诱导启动子、热诱导启动子和干旱诱导启动子等。

组织特异性表达载体

在较高等的真核生物中，有一类特殊的调控序列(启动子等)可以调控基因只能在一定的组织中才进行有效的表达。选用这样的调控序列可以构建一系列组织特异性表达载体，为研究动植物发育和人类基因治疗等提供了有效的手段。已构建的组织特异性表达载体有乳腺组织特异性表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、神经组织特异性表达载体、花药特异性表达载体和种子特异性表达载体等。

反义表达载体

反义核酸技术是人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。此技术已成为基因治疗的重要手段，其中构建反义表达载体就可以在靶细胞内直接产生致病基因的反义RNA片段。将获得的致病基因反向组入表达载体，即可构建成反义表达载体。当反义表达载体导入靶细胞后，就可转录出与致病基因mRNA互补的反义RNA，特异性地封闭致病基因的表达

反义RNA技术

反义基因技术(antisense technique)是20世纪80年代发展起来的一项基因表达调控技术，它为植物基因工程在农业上及相关产业上的应用开辟了广阔的前景。

(1)反义基因技术的基本概念和原理

所谓反义RNA(antisense RNA)是指有义(sense)DNA链转录成的、与特异的靶RNA互补结合并能抑制靶RNA表达的一段序列。转录产生反义RNA的基因称之为反义基因(antisense gene)。所谓反义RNA技术是指把一段DNA序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间，然后把此基因构建体转化到受体细胞中去(通常脓杆菌转化的方法)，通过选择培养获得转化生物体的技术。

反义基因转录生成的mRNA可以抑制具有同源性的内源基因的表达，用这种方法可获得特定基因表达受阻而其他基因表达不受影响的转基因植株。

反义基因表达载体的构建方法：第一步，以分离得到的mRNA为模板，合成反义DNA；第二步，以此反义链为模板合成有义DNA链；第三步，以细菌质粒(DNA)为载体，用限制性内切酶在靠近启动子处切割一缺口；第四步，将有义DNA插入表达载体的缺口中，即得到一表达质粒，如果启动子开始转录，表达载体即转录原来的mRNA；如果将插入的表达载体用限制性内切酶切割后，以相反的方向插入载体DNA环即表达载体转录形成反义RNA。

一般认为，在原核细胞中反义RNA与靶RNA具有特异互补性，反义RNA通过枕配对结合的方式在复制(replicate)、转录(transcropt)、翻译(translation)等过程中对目的基因起着负调控作用，但详细的机制还不清楚。在真核生物中尚未找到天然存在的反义RNA，但有一些小RNA分子可能起类似反义RNA的作用，反义RNA在真核细胞中的作用机制尚不清楚。研究发现，不仅与靶RNA 5’端互补的反义RNA有抑制作用，而且与3’端互补的反义RNA也有抑制作用，反义RNA在真核细胞中的抑制作用具高度的专一性。进一步研究认为反义RNA或DNA形成的RNA—DNA或DNA—DNA杂链，或抑制翻译起始，或抑制RNA多聚体上的翻译，或抑制从核内向胞质的转运，从而抑制目的基因在生物体内的表达。

(2)反义基因技术的特点

经过20多年的研究和应用发现，反义基因技术有许多特点使其能够很好地应用于实践，总结起来有以下几点。

①反义RNA可以高度专一地调节某一特定基因的表达，不影响其他基因的表达。反义基因的不同区段抑制效率不同，基因的部分片段(小至41 bp)就可起到抑制效果，抑制程度理论上从0～100%，这不同于基因的完全致死抑制，因此可从转基因个体中筛选到所需要的基因型。

②转化到植物中的反义RNA的作用类似于遗传上的缺陷型，表现为显性。所以被转化的植物材料不必为纯合体就可表现相应的性状，从而避免了二倍体内等位基因的显隐性干扰。

③反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，后代符合孟德尔遗传规律。

④反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作。

⑤反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更加安全。

(3)反义基因技术的应用

反义基因技术已经是相对比较成熟的技术，利用反义基因技术人为地控制生物体内某些基因的表达是植物基因工程中有巨大应用前景的研究。世界上第一个基因工程商业化园艺产品，就是利用反义基因技术将反义PG基因转入番茄而得到的耐贮运的番茄。

美国Colgene公司研制的转PG基因番茄FLAVAR、SAVRTM在美国通过美国药物与食品管理局认可，在1994年5月21日推向市场，成为第一个商业化的转基因食品。利用反义基因技术得到的反义PG番茄具有许多明显的经济价值，如果实硬度较大、耐贮运，同时果实采后的贮藏期可延长l倍，可大大减少因过熟和腐烂所造成的损失。可以说，反义基因技术为食品生物技术的发展开辟了广阔的应用前景