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双光子激发显微镜

双光子激发显微镜(英语:Two-photon excitation microscopy)是一种荧光成像技术,可以对活体组织进行深度约1毫米的成像。它不同于传统的荧光显微镜,其中激发波长短于发射波长,因为两个激发光子的波长长于所得发射光的波长。 双光子激发显微术通常使用近红外激发光,其也可以激发荧光染料。然而,对于每次激发,两个光子的红外光被吸收。使用红外线可最大限度地减少组织中的散射。由于多光子吸收,背景信号被强烈抑制。这两种效果都会导致这些显微镜的穿透深度增加。 由于其更深的组织穿透,有效的光检测和减少的光漂白,双光子激发可以是共聚焦显微镜的优越替代品。

借助于强聚焦激光束,产生非线性光学效应,其基于同时到达一个分子中的若干光子(光粒子)的相互作用。 因此,所产生的信号的强度不会随着照射光子的数量而线性增加,而是与平方率(对于双光子效应)或立方率(对于三光子效应)一致。

多光子显微镜的操作类似于共聚焦激光扫描显微镜[1]的操作。 然而,虽然共聚焦激光扫描显微具有50-80 μm的穿透深度,取决于制剂,可以与多光子显微镜一起使用更深的区域,例如,200 μm,在非常有利的情况下甚至可达到1000 μm(= 1 mm)。 活体组织的这一图像可能是用其它方法无法成像。

目录

概念

双光子激发采用双光子吸收,这一概念首先由玛丽亚·格佩特-梅耶(1906-1972年)在1931年的博士论文中描述,并且首次在1961年被Wolfgang凯撒(Wolfgang Kaiser (physicist))使用激光激发在CaF2:Eu2 +晶体中观察到。 艾萨克·阿贝拉(Isaac Abella)于1962年在铯蒸气中表明,双光子激发单个原子是可能的。

双光子激发荧光显微镜与共聚焦激光扫描显微镜具有相似性。

开发

双光子显微镜由温弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler于1990年在康奈尔大学的瓦·韦伯(Watt W. Webb)实验室开创并获得专利[2]。他们将双光子吸收的概念与使用激光扫描仪相结合。在双光子激发显微镜中,红外激光束通过物镜聚焦。 通常使用的钛-蓝宝石激发激光具有大约100飞秒的脉冲宽度和大约80MHz的重复率,允许两个光子吸收所需的高光子密度和通量,并且可以在宽波长范围内调节。 具有325fs脉冲的锁模的Yb掺杂光纤激光器也已用于胶原成像,证明胶原蛋白的穿透深度超过320μm,这相当于当耦合到传统钛-蓝宝石激发激光时可实现的250-300 μm的深度。

视频

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参考文献