Β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶（英语：β-galactosidase， β-gal或β-gal ）也称为乳糖酶 ，是一种水解酶，催化β-半乳糖苷水解成单糖。使β-半乳糖苷酶作用的底物包括神经节苷脂GM1、乳糖苷、乳糖、各种糖蛋白。它可通过破坏糖苷键化将β-半乳糖苷水解为单糖。包括含有半乳糖的碳水化合物，其中糖苷键位于半乳糖分子上方。不同的β-半乳糖苷酶的底物包括神经节苷脂GM1，乳糖基神经酰胺，乳糖和各种糖蛋白。
目录
属性与功能
人体必需的酶
β-半乳糖苷酶是人体必需的酶，它是一种外糖苷酶 ，专门水解在半乳糖和其有机部分之间的β- 糖苷键。它也可以裂解岩藻糖苷和阿拉伯糖苷，但效率低得多。蛋白质缺乏会导致半乳糖唾液酸中毒或Morquio B综合症。在大肠杆菌中，lacZ基因是β-半乳糖苷酶的结构基因。它是可诱导系统lac操纵子的一部分，当葡萄糖水平低时，该操纵子在乳糖存在下被激活。 当葡萄糖水平足够时，β-半乳糖苷酶的合成停止。
β-半乳糖苷酶具有基于相似序列的许多同源物。少数是进化的β-半乳糖苷酶（EBG），β-葡萄糖苷酶 ，6-磷酸-β-半乳糖苷酶，β-甘露糖苷酶和乳糖酶-芦硫苷水解酶。 尽管它们在结构上可能相似，但是它们都有不同的功能。[“糖苷水解酶，家庭1，β-葡萄糖苷酶（IPR017736）<InterPro <EMBL-EBI”。www.ebi.ac.uk3]β-gal被L-核糖，非竞争性抑制剂 碘和竞争性抑制剂苯硫基-β-D-半乳糖苷（PETG），D-半乳糖内酯， 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）抑制 ，和半乳糖。
产生能量的关键提供者
β-半乳糖苷酶对生物很重要，因为它是产生能量的关键提供者，并且通过乳糖分解为半乳糖和葡萄糖而成为碳的来源。 这对于乳糖不耐症社区也很重要，因为它负责生产无乳糖的牛奶和其他乳制品。 许多成年人缺乏乳糖酶，该酶具有相同的β-gal功能，因此他们无法正确消化乳制品。 β-半乳糖用于酸奶，酸奶油和一些奶酪等乳制品中，经过酶处理后可以分解任何乳糖，然后再食用。 近年来，已经通过基因替代疗法研究了β-半乳糖苷酶作为乳糖不耐症的潜在治疗方法，可以将其放入人类DNA中，以便个人可以自行分解乳糖。
β-半乳糖苷酶，它也可能裂解岩藻糖和阿拉伯糖所形成的糖苷，但是效率比较低。 它是人体中所必需的酶。在此蛋白质不足的情况下可能导致Galactosialidosis(为一种溶酶体储积病)或莫尔基奥乙综合征。在大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶的基因--lacZ的基因为诱导型系统的一部分，乳糖操纵子是于低血糖时在乳糖的存在下被激活。
监测基因表达的指标印记
分子生物学中经常使用β-半乳糖苷酶作为监测基因表达的指标印记。β-半乳糖苷酶也表现出蓝/白筛选重组复制中称之为α-互补形成的现象。这种酶可以分开为二种胜肽，分别为LacZ基因α和LacZΩ，这两者自身分别都不是反应端，但是当两者同时存在时，会自发地重新组合成一个有功能的酶。这个特性被利用在许多复制载体(克隆)，其中在有lacZα基因的质体表现可以将实验室的大肠杆菌病株中的LacZΩ基因转换为另一个突变基因。然而，当DNA片段插入到载体中，制作LacZα的被打乱，因此细胞没有表现β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶活性表现的存在与否可透过X-gal的检测来判断，如果质体没有插入此外来基因，就能成功表现出β-半乳糖苷酶的活性，就能成功分解X-gal，使菌落成为蓝色。反之，插入外来基因的质体无法分解X-gal(因为β-半乳糖苷酶无法表现)，而成为白色的菌落。
1995年，由Dimri等人。提出了β-半乳糖苷酶具有在PH 6.0 的新亚型（衰退与β-半乳糖苷酶和SA-β-半乳糖苷酶(衰老)有关）这被拿来特别表达老化（细胞的不可逆的生长停滞）。具体的定量测定法甚至开发了他的感应检测。 然而现在已经知道，这是溶酶体内源β-半乳糖苷酶的积累，而使其过度表现不需要的衰老。尽管如此，它仍然是最广泛使用在衰老以及衰好细胞的生物标记物，因为它具有相当可靠的和容易检测之特性。
结构
大肠杆菌1024个胺基酸中的β-半乳糖苷酶最初是在1970定序出来，而其结构是在24年后，也就是1994年确定该蛋白是一个464 - kDa的 同源四聚体与2,2,2点对称性且每个单元的β-半乳糖苷酶包括了五个领域 ; 第一区域是胶卷型桶，第二区域和第四区域为纤连蛋白III型状的桶，第五区域是β-三明治型，而中央的第三区域是TIM型桶。
活性端位于第三个结构域。活性端是由四聚体两个亚基的元素所组成的，并且在四聚成二聚体活性端的解离除去中的扮演关键要素。β-半乳糖苷酶的末端序列中，α-肽参与了于亚基介面中的的α-互补。其残基22-31帮助以稳定的四螺旋束形成该界面的主要结构，残基13和15则有助于激活接口。这些结构上的特征为为α-互补的现象，为缺失的氨基末端片段的结果在非活性二聚体的形成提供一个合理的解释。
大肠杆菌 β-半乳糖苷酶的1,024 个氨基酸于1970年首次测序 ，其结构在24年后的1994年确定。该蛋白是具有2,2,2-点对称性的464 kDa同型四聚体 。β-半乳糖苷酶的每个单元均由五个结构域组成； 域1是果冻卷式桶 ，域2和4是纤连蛋白III型桶，域5是β三明治，而中央域3是TIM型桶 。
第三个域包含活动站点。活性位点由四聚体两个亚基中的元素组成，四聚体解离成二聚体可去除活性位点的关键元素。 β-半乳糖苷酶（参与α-补体的α-肽）的氨基末端序列参与亚基界面。 其残基22-31有助于稳定形成该界面主要部分的四螺旋束，而残基13和15也有助于活化界面。 这些结构特征为α-互补现象提供了理论依据，其中氨基末端区段的缺失导致无活性二聚体的形成。
催化反应
β-半乳糖苷酶的活性端通过“浅层”与“深层”结合基质来催化水解双糖。一价的钾离子（K+），以及二价的镁离子（镁2+）需要酶的最佳活性。以β-核苷间键为基质经由谷氨酸侧链上的羧基终端裂解而成。 在大肠杆菌中，谷氨酸-461被认为是取代反应的亲核试剂。然而，现在已经知道谷氨酸-461是一种酸[催化剂]。相反的，谷氨酸-537为实际的亲核试剂，他是结合到半乳糖的中间体。
在人类中，是由Glu-268扮演水解反应的亲合试剂。
应用
β-半乳糖苷酶检测常用于遗传学、分子生物学，以及其他生命科学。可用于蓝/白筛检测中，有活性的酶可以用X-gal来进行检测，会在裂解β-半乳糖苷后形成一个深蓝色的产物5-溴-4-淀蓝，并且容易辨识和量化。它的生产可以透过非水解性诱导结构异构物中的异乳糖─IPTG，从lac操作者中结合并释放lac操纵子，从而使转录起始端继续进行。
因为他的高表现性质以及它在衰老细胞中的溶酶体累积的特性。尽管有其局限性，它可被当作一个老化的标志物，借由进行体内和体外在定性和定量可用以测定老化程度。
反应
β-半乳糖苷酶可以催化生物体中的两种不同反应。 在一个过程中，它可以经历一个称为反式半乳糖基化反应的过程，以制造半乳糖 ，从而为β-gal的产生创造一个正反馈回路 。 它还可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，然后进行糖酵解。β-半乳糖苷酶的活性位点通过“浅”（非生产位点）和“深度”（生产位点）结合催化其二糖底物的水解。 当酶处于“开放”构象时， 半乳糖苷（例如PETG和IPTG）将结合在浅位点，而当“闭合”构象时，过渡态类似物（例如L-核糖和D-半内酯内酯）将结合在深位点。酶促反应包括两个化学步骤，半乳糖基化（k2 ）和半乳糖基化（k3）。半乳糖基化是反应中的第一个化学步骤，其中Glu461将质子提供给糖苷氧，导致半乳糖与Glu537共价键合。 在第二个步骤中，半乳糖基化，当Glu461接受质子时，共价键断裂，用水代替半乳糖。 在每个步骤之后，在反应过程中，酶的深位会出现两个过渡态。当水参与反应时，形成半乳糖，否则，当D-葡萄糖在第二步骤中充当受体时，发生转半乳糖基化。动力学测定该蛋白质的单个四聚体以每分钟38,500±900个反应的速率催化反应。单价钾离子 （K+）和二价镁离子（Mg 2+ ）是该酶最佳活性所必需的。底物的β键被谷氨酸 侧链上的末端羧基裂解。
在大肠杆菌中 ，Glu-461被认为是取代反应中的亲核试剂 。然而，现在已知Glu-461是酸催化剂。相反，Glu-537是实际的亲核试剂，与半乳糖基中间体结合。在人类中，水解反应的亲核试剂是Glu-268。Gly794对β-gal活性很重要。它负责将酶置于“封闭”，配体结合，构象或“开放”构象，对活性位点环起“铰链”的作用。 不同的构象确保仅优先结合发生在活性位点。在慢的底物存在下，Gly794活性增加以及半乳糖基化的增加和半乳糖基化的减少。
使用
β-半乳糖苷酶测定法经常用于遗传学 ，分子生物学和其他生命科学中 。可以使用人工显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷X-gal来检测活性酶。β-半乳糖苷酶将切割X-gal中的糖苷键并形成半乳糖和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚，后者会二聚并氧化为5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo，易于识别和量化的蓝色产品。例如用于蓝白色屏幕 。它的产生可能是由半乳糖的非水解类似物 IPTG诱导的，该类似物与lac操纵子结合并释放lac阻遏物，从而使转录的启动得以进行。
它在分子生物学中通常用作报告基因标记，以监测基因表达。它还表现出称为α-互补的现象，该现象构成了重组克隆蓝/白筛选的基础。 该酶可以分为两个肽，LacZα和LacZΩ，它们都不具有活性，但是当两者同时存在时，会自发重组为功能性酶。 在许多克隆载体中利用了这种特性，在质粒中lacZα基因的存在可以反演在大肠杆菌特定实验室菌株中反编码LacZΩ的另一个突变基因。 然而，当将DNA片段插入载体中时，LacZα的产生被破坏，因此细胞没有显示出β-半乳糖苷酶活性。可以通过X-gal检测活性β-半乳糖苷酶的存在与否，当被β-半乳糖苷酶切割时会产生特征性的蓝色染料，从而提供了一种简便的方法来区分质粒中克隆产物的存在与否。在对白血病染色体易位的研究中，Dobson及其同事在小鼠中使用了LacZ融合蛋白，利用β-半乳糖苷酶的寡聚趋势，暗示寡聚性在MLL融合蛋白功能中的潜在作用。
1995年，Dimri等人。 有人提出了一种新的β-半乳糖苷酶同工型，在pH 6.0下具有最佳活性（衰老相关的β-gal或SA-β-gal ），将在衰老中特异性表达（细胞的不可逆生长停滞） [1]。甚至开发了专门的定量检测方法进行检测。但是，现在知道这是由于溶酶体内源性β-半乳糖苷酶的过表达和积累引起的，衰老不需要其表达。 然而，由于它可靠且易于检测，因此它仍然是衰老和衰老细胞中使用最广泛的生物标记。
进化的β-半乳糖苷酶
某些细菌（包括大肠杆菌 ）还具有其他β-半乳糖苷酶基因。 将lacZ基因缺失（但仍含有半乳糖苷通透酶基因lacY ）的菌株接种到含有乳糖（或其他3-半乳糖苷）的培养基中时，发现了第二个基因，称为进化β-半乳糖苷酶（ ebgA ）基因。碳源。 一段时间后，某些殖民地开始增长。 但是，EbgA蛋白是无效的乳糖酶，不允许在乳糖上生长。 两类单点突变可显著提高ebg酶对乳糖的活性。因此，突变酶能够替代lacZβ-半乳糖苷酶[2]。EbgA和LacZ在DNA水平上是50％相同，在氨基酸水平上是33％相同。活性ebg酶是ebgA基因和ebgC基因产物的1：1比率的聚集体，ebg酶的活性形式是α4β4杂八聚体。
视频
参考资料
- ↑ 一种生物标记物，可在培养物中和体内衰老的皮肤中识别衰老的人类细胞程序Natl/美国科学学院
- ↑ 在大肠杆菌中发展新的乳糖酶功能所需的突变数细菌学杂志