空間細胞培養
空間細胞培養，用於研究具有製藥前景的動物細胞、植物細胞的空間培養。研究空間細胞培養方法和微重力條件對細胞生長、代謝、合成及分泌物活性的影響。在神舟3號上使用我國自行研製的細胞反應器進行了"人體組織淋巴瘤細胞"、"人大顆粒淋巴細胞"、"抗衣原體蛋白小鼠淋巴細胞雜交瘤細胞"、"抗天花粉蛋白小鼠淋巴細胞雜交瘤細胞"的培養。
| 空間細胞培養 | |
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目錄
研究意義
征服太空，開發利用太空資源是人類長期以來的夢想。隨着科學技術的進步，今天人類的這一夢想正在逐漸地變為現實。目前，人類對短期進入微重力環境適應過程中的有關生物學機制有些初步了解，長期(數年)在空間生活的影響還有待進一步認識。細胞是構成生命有機體的基本結構和功能的單位，不管在失重條件下人體在生理等方面表現如何，微重力環境下產生的所有效應均是單細胞本身或細胞間相互產生反應的最高形式。著名的細胞生物學家B.Wilson早在1925年就指出，生命科學問題的答案必定從細胞中去尋找。開展空問細胞科學研究是人類認識及征服太空的必由之路。但是細胞的生長需要一定的條件，包括溫度、濕度、氧氣、養料、pH等，它們有複雜的代謝需要，並且對器皿壁的相互作用和流體應力十分敏感，尤其對纖弱的哺乳動物細胞更是如此，因而空間細胞培養的研究是開展空間細胞生物學研究的基礎與前提條件。[1]
近年來，生物醫學界報道了許多成功的臨床應用例子，如單克隆抗體、基因工程重組蛋白、細胞因子、疫苗等，這些生物技術產品都有很高的經濟和社會效益，往往涉及動、植物細胞的大規模培養技術。微重力環境為細胞培養提供許多有利之處，由於空間無沉降無對流的特性，物質可以均勻懸浮，細胞不會因重力場的影響而沉降堆積在一個表面，這對於進行細胞的高密度培養，提高介質的利用率和單位容積的產量，減少其它蛋白的污染都是有利的;並且空間純淨的培養環境，獲得更加均一、更加純淨的物質的潛力，防止污染等，為空問製藥帶來了許多有利之處;特別是近些年來報道空間細胞的生物合成和分泌作用發生改變，某些重要蛋白質的產量和品質可以提高;在微重力下細胞具有三維生長的潛能。因而空間細胞培養是目前國際看好的三大空間生物技術(蛋白質結晶，細胞培養，生物分離)之一，也是空間生物加工的重要組成部分。[2]
研究概況
培養裝置
國外在空間細胞培養方面所用的裝置在70年代初期一般都是由小的培養容器組成，僅允許進行一次性批量試驗，比較簡單，無傳感器和在線監測。這些放在培養箱內的小容器80年代陸續在空間作了試驗。
80年代研製的培養箱和細胞培養小室能用電池或飛船動力系統來維持37℃(+/-1℃)恆溫，在培養箱裡的培養小室採用活塞密封，活塞能夠移動來調整室內的體積，實驗用藥品如激活劑、固定劑的加入需要通過一個厚的硅橡膠膜。在航天飛機STS-8，STS-9和STS-40上飛行過的培養箱曾包含4個12ml的培養小室和8個注射器。
所有早期的空間細胞生物學實驗可稱為批量培養實驗，培養時間很有限，因為細胞被培養在一個固定容量的培養基中，隨着時間的延長，營養物質會耗竭，代謝產生的廢物會蓄積。於是動態細胞培養系統應運而生。80年代後期瑞士/德國利用滲透泵原理研製了一種新的動態細胞培養系統(DCCS)。它是一個封閉的系統，該系統設有氣室和2個培養小室，一個為批量培養，一個為灌注式培養。培養室容積為200ul，新鮮培養基儲備庫的容量達230ul。自驅動的滲透泵可以1ul/h的流速將新鮮培養基供應給細胞。DCCS適合於放人歐空局(ESA)的生物櫃的1型容器(81×40×20 mm)內。該裝置是由ESA的PRODEX計劃資助完成的。第一次用DCCS進行的實驗是1989年在前蘇聯飛行14天的生物衛星Biokosmos 9上進行，研究了植物原生質體的生長和發育。第二次是在1992年國際微重力實驗室IML-1的飛行任務中，研究了微重力對倉鼠腎細胞的影響。與成批培養方式相比，DCCS的細胞生長得更好，產生更多的組織纖溶酶原激活物。
為了對高效益的產品如藥物，以及對支持人類生存的受控生態生命支持系統補充食物供應及廢物再循環進行有效的空間生物加工，生物反應器的設計與製作被提到了日程上。生物反應器(bioreactor)系統包括中空纖維式、薄膜式和灌注式等。80年代下半期美國Johnson空間中心研製了有相當精度可監測控制的系統。細胞在有緩慢攪拌的(15rpm)旋轉式的帶過濾的灌注系統內培養，工作容積250ml。過濾系統可以存留住細胞和微載體，氣體交換通過一中空纖維式的充氧器來完成。整個裝置放在有濕度控制的c02培養箱內，有通道監測和標準培養參數的控制，如濕度、pH、底物、產物濃度等。90年代用於酵母細胞培養的小型化生物反應器裝備有加樣、pH值控制、氣體交換、連續的新鮮培養基供應和在線檢測能力。發展這樣硬件設備所受到的真正挑戰來自要求商品化生物反應器集成幾乎所有功能，這需要把它的體積由原來的l升降至365ml(87×63×6mm)，以適應生物櫃的II/E型容器。連續培養酵母細胞的新型微型生物反應器被發展了起來，體積87×63×63 mm，重量610 g。100ml的新鮮培養基能通過微量泵以不同的速率輸送入3ml的培養小室。培養物用磁力攪拌子攪拌;pH值、溫度和還原電勢的變化通過微傳感器監視;有一個窗口允許觀測培養狀態;數據被發往地面分析。這個裝置被ESA選用於1994年7月的IML-2飛行任務。生物反應器所涉及的傳感器、pH控制、營養泵和液流計均基於硅半導體技術。經過兩輪的成功飛行測試，新一代的裝置正準備用於2000年的飛行試驗。
培養方法
在地面，用常規方式培養的細胞的生長受到重力的作用，引起細胞聚集物的沉澱。另外，目前實驗室和生化工程所用的機械懸浮法(如搖床、機械攪拌、氣升法等)使細胞受到剪切力的作用，既容易損傷組織細胞，也影響細胞聚集物的形成。而在微重力環境下，細胞聚集物能向着三維方向生長，從而給了科學家一個模擬體內情況研究細胞間相互作用和組織發育的良好模型。通過細胞單培養(mono-culture)和共培養(co-culture)可以發現有價值的細胞接觸方式和作用細節。細胞培養器曾運送到和平號空間站並整合在其生物技術系統(ms)內。培養時間則由光鏡和照相監視輸出來決定，樣品可固定或低溫保存以便回地面分析。這是NASA Johnson空間中心開始研究的，並已初步取得了很好的結果。
在生物材料加工方面，已分離出地面很難分離的哺乳動物特化細胞和蛋白質，其純度比地面所分離的高4~5倍，分離速度提高柏0~700倍，這些都給藥物學研究帶來了新的生機。全球最大的製藥公司已與美國宇航局合作，試圖在太空生產出治療癌症、糖尿病、肺氣腫及免疫系統失調的藥物。預計到21世紀20年代，在"阿爾法"空間站計劃建造的六個實驗室里開展的一系列工作，將為生物、醫藥、工業的進步和人類生活條件的改善開闢捷徑。
國外關於空間細胞培養裝置的發展趨勢是針對空間生物技術的商業化問題，進一步研究細胞對微重力條件的反應;改進設計在微重力下的培養裝置;改進通道監測，發展靈敏的生物傳感器，使能精確有選擇性的監測介質中的各類分子;改進高性能的化學上限定的培養介質，達到更高密度和高產的培養等等。
培養條件
80年代後期國外在空問細胞飛行裝置內普遍地裝上了1g參照離心機，從而可以在同樣的條件下進行對比試驗，使微重力在細胞水平的影響可以得到比較規範的研究和確認。
細胞培養時，貼壁依賴性細胞的一個基本特徵是具有貼附到物體表面以便生長的能力和需要。細胞通過分泌一些細胞外基質使自身與固體支持物進行接觸並固着。在地球上，通常細胞在沉降到培養瓶底面和微載體上時，通過接觸粘附到固相表面上。STS-8航天飛行試驗中證實，在空間細胞膜和黏附蛋白的分泌是正常的，人腎細胞在微重力環境中甚至比地面對照更有效地貼附在微珠上，因此將細胞運往空間，用冷凍和其他方法進行固定化，在需要的時候進行培養是可行的。這對於未來的長期空間探索和在空間站進行生物學基礎研究，以及生物技術的商業開發都是極為重要的。
微囊化是固定細胞的一種方法，它是一個由半透性多聚物層包圍的藻酸鹽所形成的複合微滴。這種多聚物是多孔的，可使液體自由進出，但也保護了細胞，可減少在生物反應器中由於發射和返地時重力急劇變化等因素引起的剪切力的損傷作用。
在哺乳動物細胞保存研究方面，有報道用subcooling-in-oil技術保存有生物活性的細胞，以便於今後在國際空間站的研究。用於宇航試驗的乾燥血細胞保存方法，避免了使用冰箱等冷凍設備。標準的收集宇航員血樣的方法是在真空管中的膠分離法(濾過液體成分，保留細胞成分)。在微重力條件下於燥收集和保存可更好地保存樣品的化學特性，如80%的常用分析物可不用電解質保存數月。
空間細胞的培養應是無菌的，細胞應在即將發射之前放人飛船。各種細胞是有可能在軌道內培養30天左右的。培養類型可以適用於懸浮、貼附的動植物細胞，動物組織，細菌和微小的非飼養類的微生物。新鮮細胞可來自輸送到ISS的凍存細胞。3、10或30ml培養體系需維持在4~40°C和適當的濕度、pH下、二氧化碳、氧氣濃度均嚴格控制在一個大氣壓下。用相差/熒光顯微鏡可觀察到細胞的圖象，如果需要，圖象數據能被發回地面實驗室。作為參照，可以在空間站做人工重力環境下(0.1~2.0 g)的對照實驗。營養物或特殊添加劑(如為方便在地面進一步研究所需的終止實驗樣本的固定劑)被自動加入，代謝廢物也能自動被去除。標本或培養基質可在軌道直接進行及時的操作或凍存。一些基本的操作，如溶液混合、核酸抽提、胰酶消化、過濾、濃縮，可用半自動化的方法，或由宇航員協助。
地面模擬
由於空問飛行研究的費用昂貴，進人空間的機會難得，並受到運載能力等的限制，同時也為確保難得和昂貴的空間試驗的成功，十分需要首先在地面進行大量的預試驗，以提高空間試驗的安全性和可靠性。國外的經驗表明，一次成功的飛行試驗往往需要事先經過約2年左右時間的地面研究積累。這也要求我們設計製造各種模擬微重力效應的裝置來進行空間細胞培養的地面研究。目前主要的地面模擬裝置有迴轉器(clinostat)、隨機定位機(random positioning machine，or tridimensional clinostat)、轉壁容器(rotating wall vessel)、細胞培養艙(cell culture module，CCM)、自由落體機(free fall machine)等。
當前細胞科學面臨的挑戰是，絕大多數細胞培養產生的是單細胞層的標本，而我們迫切需要了解的是細胞之間怎樣相互聯繫協同工作。空間試驗表明，細胞在微重力下具有類似於在活體內的三維生長的潛能。NASA的Johnson空間中心研製的生物反應器系統是解決這一問題的有效嘗試。作為研究微重力效應對於細胞影響的模型，它的核心是一個轉壁容器，包括慢轉橫管(slow turing lateral vessel)和高位轉管(high aspeet rotating vessel)，通過旋轉含有培養細胞的液體培養基來中和重力效應，在一個較大剪切力範圍內(0.2~0.92 dyn/cm)進行模擬研究，使細胞能以近似自然的方式生長。腸癌、小腸和軟骨細胞的地面培養研究已獲得極大成功。在長時問的空間任務中，大樣品生長能被用來研究細胞的擴張生長和分化，如工程化的複雜組織和慢生長腫瘤的模型。
細胞培養艙(CCM)是為飛行和地面對照實驗而設計的生物反應器系統，其基本結構是利用中空纖維來輸送和交換養分和廢物。氧氣輸送和二氧化碳緩衝系統摻人到培養基循環中。CCM還包括保存試劑和樣品的冷凍室。CCM設計有三個區，每個區可以放置四個大的或六個小的生物反應器盒。生物反應器根據其大小可以容納106孔或幾個小結節愈傷組織或組織纖維。纖維孔徑從4000 Dalton到0.5微米可選。研究者可選擇單一供應物的再循環或小容量定時更換。通過自動添加反應試劑，定時取樣，許多實驗參數和應答可被研究。在微重力下可完成特定刺激與微重力相互作用的時間分析圖示。但是由於其物理條件(尺度、重量和電源)的制約，操作是有限的，而實驗往往需要對一個樣品重複幾次操作或需要同時對一個樣品進行兩種操作。總之，簡單的直截了當的試驗成功的機會要大得多。
隨機定位機器由日本的T.Hoson發明，Fokker Space，NL製造，可以通過兩個框架的隨機旋轉模擬微重力環境，承載重量能達到20 kg。
自落機由ESA的D.Mesland發明，CCM，NL製造，持續800ms的微重力條件可通過重複性的1~2 m自由落體運動接着以持續40ms的15g反彈產生出來。
空間細胞培養地面模擬的重要性及其在理論與實踐上的意義正受到日益重視，國外這方面的研究進展很快，特別在美國和德國。地面模擬研究的成果已經應用於臨床實踐。我國目前尚處於起步階段，有少數幾個單位已開展了這方面的研究，國家在組織工程方面已實施了973基礎研究項目。對各種可模擬微重力效應裝置的需求正在不斷的增加。相信不久將來在這方面會有所進展和突破。
我國研究情況
我國空間細胞培養研究經歷了一個比較長的起始發展階段，1988年8月5-13號，我國首次進行了高等哺乳動物細胞的衛星搭載試驗，細胞樣品被培養在平底塑料管中，培養溫度與衛星艙內同步，總體積6毫升。1990年10月5-13號，在第二次細胞飛行試驗中，培養條件有所改善，細胞生長在玻璃培養瓶內，總體積35毫升;培養瓶放在有溫控材料控溫的培養罐內，培養溫度為36±1℃，罐內設有遙測通道。由於空間環境的複雜性，空間的實際情況與地麵條件下的模擬和計算結果有較大出入，溫控裝置未能按原定計劃工作，它實際上僅提供了約4天的正常生長溫度，僅有極少量癌細胞成活。1992年10月7-14號第三次衛星搭載試驗時，細胞培養條件在原來的基礎上增加了一組電池和加熱板，從而保證了一定的溫度條件，初步取得了較好的試驗結果。1994年7月3-18號第五次衛星搭載試驗時，小鼠腹腔巨噬細胞和雜交瘤細胞樣品第一次在較好的生長條件下進行培養。細胞生長在改良的動態細胞培養系統內，該系統包含兩個細胞反應器，每一個反應器中有培養液儲存系統，換液系統，兩個細胞培養室及氣室。氣室中初始氣體為含8%CO2、25%O2的混合氣體;氣室與培養室之間有一層可以進行氣體交換的薄膜相隔。每一反應器中有一個培養室，由滲透泵驅動換液，培養液流速大約為60微升/天，稱為流動培養室。另一個非換液室稱為靜止培養室。溫控裝置維持培養室內溫度約為36±1℃，培養液儲存室溫度約為15±2°C。經過15天的空問飛行試驗表明我國自行研製的這一裝置基本適合巨噬細胞的培養，貼附在微載體上的巨噬細胞在改良的動態培養系統內存活良好。裝置還需要進一步改進和完善。目前，一個更高水平和更大容量的細胞反應器正在研製中。