佐伯惟定
继任家督
天正6年(1578年)祖父惟教与父亲惟直、叔父镇忠于耳川之战败死后继承第14代家督，之后丰萨合战中，抵抗北上的岛津军而不断努力。天正十四年（1586年）十月，岛津家久统率一万兵马挥军北上，从日向往丰后攻打，同时岛津义久也派出许多使者招降大友家臣，在周遭许多同僚响应臣服时，佐伯惟定却坚持不肯投降。
期间，佐伯惟定请伊东旧臣山田匡得协助，扩充整备宇山城、 八幡山砦等各处支城积极防战，在岛津家久派遣僧人玄西堂来劝降时将二十名使者全数杀害，以示坚决的抗战意图。
对抗岛津
在明白招降无望后，岛津家久对栂牟礼城发动攻势，命土持亲信及新名亲秀率两千兵马火烧岸河内，之后进击坚田，惟定在听闻斥侯传来的军情后，将城中兵力一分为三，经塩月、江头、西野分别赶赴坚田迎战，在猛将山田匡得的奋战下，佐伯惟定终将岛津军击退，逐出岸河内（坚田合战）。
十二月，佐伯惟定出兵攻打柴田绍安、左京进父子所在的星河城，在城落之后佐伯惟定补杀了柴田绍安之子左京进、次郎及其一族，令柴田绍安大为惊恐而再度投降大友家，被佐伯惟定利用为先锋攻打天面山城。在12月18日击退了户高将监率领的岛津军之后，佐伯惟定与甫突破新纳忠元包围的冈城城主志贺亲次展开炽烈的反击，呼应丰臣秀长，顺势恢复大友家的领地，将当初被岛津家寝返的南郡诸城逐步夺回大友家，支持到丰臣秀吉本阵出动。
天正十五年（1587年）正月，丰臣秀吉正式开始进行九州讨伐，佐伯惟定于同年2月攻克土持亲信所在的朝日岳城，并在3月17日岛津义弘、 家久两军合流回归日向时，于日向、丰后国境的梓峠发动急袭，将岛津军击溃，在战场上大为活跃的佐伯惟定因而得到秀吉所赐的感状。
藤堂家臣
在丰臣秀吉出兵朝鲜时，佐伯惟定做为大友军的一员从军参阵，不料主公大友义统因风闻敌方大军来袭的消息后自前线逃跑，引起秀吉大怒，文禄2年（1593年），领地被没收。失去领地的佐伯惟定后来因受到羽柴秀保赏识，将他推荐给笔头家老藤堂高虎担任家臣，担任率领500人的与力，方能维持生计。文禄4年(1595年)，藤堂高虎转封伊予国宇和岛得到7万石的封地时，佐伯惟定也从高虎处拜领了两千石的俸禄，与藤堂良胜交替担任国府城城代。庆长之役时，原本留守板岛城，后来渡海参战。
庆长五年（1600年）关原之战时，主君藤堂高虎因为素与德川家康修好而投入东军，是役之中佐伯惟定并未参战而是被任命伊予板岛城留守居役的职务，战后藤堂高虎被转封至伊势津城，此后十年间身为藤堂藩士之一的佐伯惟定，主要负责领内的各城的普请职务，积极开发津城的城下町-佐伯町。
关原之战后，德川家康开创江户幕府，身任征夷大将军，随后又把将军之位让于世子秀忠，称大御所。但是居于大阪城中的丰臣秀赖，终究是德川政权的不安定因素，于是家康费尽苦心方硬借方广寺钟铭事件挑起大阪之战。在庆长19年（1614年）大坂冬之阵中，佐伯惟定在高虎麾下率领士队十骑、卒队四十人出阵，11月26日与藤堂高刑合作担任右先锋。大坂夏之阵时担任游击军的指挥，在右先锋被长宗我部盛亲部队击溃后，与藤堂高吉共同担任左先锋，战后因功增加五百石，总共领有四千五百石的知行领位列藤堂藩的重臣之一。
元和四年(1618年)，佐伯惟定逝世，享年五十岁，法名宗忠功月大禅定门。家禄由其子惟重继承，此后佐伯家世代担任藤堂家臣直到明治时代。