代謝工程學

代謝工程學

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代謝工程學（Metabolic engineering）又稱途徑工程，一般定義為通過某些特定生化反應的修飾來定向改善細胞的特性，或是利用重組DNA技術來創造新的化合物。

目錄

正文

從人類第一次成功將一個外源基因導入細菌細胞，我們就意識到微生物細胞可以成為眾多化工產品的微型工廠。但是很快人們發現，儘管複雜如胰島素的分子可以通過一個基因的過表達生產，但簡單如乙醇的小分子生產卻涉及眾多基因的調控。就在人們熱衷於利用此技術生產醫藥分子的同時，1980年代，也有研究關注了這項技術背後的代謝複雜性及其調控問題，如代謝通路的熱力動力學，代謝步驟的動力控制，遺傳通路的設計等等。這些活動有兩篇代表性論文，其很關鍵性地推動了代謝工程的建立。（兩篇論文如下）

Stephanopoulos G, Vallino J. 1991. Network rigidity and metabolic engineering in metabolite overproduction. Science 252(5013):1675–81

Bailey JE. 1991. Toward a science of metabolic engineering. Science 252(5013):1668–75

代謝工程與遺傳工程不同，前者關注整合的代謝通路和調控網絡，後者更多的關注單一基因或酶的操縱。

代謝工程從誕生時起就有顯著的工業目標，因為其一開始就意在滿足更加有效的催化反應用於生產感興趣的工業品，如能源，化工品和藥品。使用生物催化生產一個產品很容易，但是實現比率、產率和速率的最優化是很難的。這種困難導致代謝過程不得不努力發展代謝通路的設計、構建和最優化。

今天的代謝工程，已經不僅僅是生產貴重的稀有的化工品，而是能夠放大尺度生產大宗化工品。未來的代謝過程將大幅度提升生產能力和應用範圍。一方面，基因合成技術和異源表達越來越成熟，另一方面，組學的發展為更全面了解微生物的代謝地圖提供了技術準備，這包括模式生物也包括稀有微生物。組學提供的地圖和基因多樣性信息將為代謝工程提供無限可能。

簡介

代謝工程使指利用基因工程或是分子生物學技術，將生體內之代謝路徑改變，通常改變生體內化學反應之酶。代謝工程技術目前以微生物利用為主，改變工業微生物之代謝路徑，生產所需要的化學物質，如抗生素。 這一概念由美國學者BaileyJE於1991年首先提出。其將代謝工程定義為：用重組DNA技術來操縱細胞的酶運輸和調節功能從而改進細胞的活性。Stephanopouls等認為，代謝工程是一種提高菌體生物量或代謝物產量的理性化方法。Cameron等的定義則精煉一些，即用重組DNA技術有目的地改造中間代謝。

定義

代謝工程學是指利用基因工程或是分子生物學技術，將生體內之代謝途徑改變，通常改變生體內化學反應之酶。它來自於發酵學。代謝工程技術目前以微生物利用為主，改變工業微生物之代謝路徑，生產所需要的化學物質，如抗生素。

起源

這一概念由美國學者Bailey J E於1991年首先提出。其將代謝工程定義為：用重組DNA技術來操縱細胞的酶運輸和調節功能從而改進細胞的活性。Stephanopouls等認為，代謝工程是一種提高菌體生物量或代謝物產量的理性化方法。Cameron等的定義則精煉一些，即用重組DNA技術有目的地改造中間代謝。

研究內容

與其他傳統的工程領域相比，途徑工程同樣強調解析與組合兩個特定的步驟，然而在很大程度上途徑操作過程基本上是分子生物學原理的一種技術表現形式，真正意義上的工程方面的成份並不占主導地位。嚴格地講，生化反應過程的有關內容並不能定義為途徑工程。更多更顯著的工程成份只是反映在途徑工程的分析部分，如怎樣辨認能反映細胞生理狀態的主要參數？怎樣利用這些信息組織一個代謝網絡的控制設計，並確定合理靶點以修飾構建特定的物種？怎樣進一步評估基因或酶的真實修飾效果，以實施新一輪的途徑修飾直到最佳狀態的確立？取代普通的定向靶點篩選程序，怎樣預測一個合理的過程以確定途徑操作的最有效靶點？上述問題是途徑工程分析部分應解決的問題。

途徑工程的一個嶄新觀點是關注代謝途徑的組合而非單一的反應，因此它必須考察完整的生化反應網絡，重視途徑和目標產物的熱力學可行性、代謝流及其控制。從傳統的單一酶反應分析向相互作用的生化反應系統轉移是這一組合觀點的精髓，其中代謝網絡的概念尤其重要，只有這樣，生物體代謝運動和細胞功能的圖視效果才能被強化。因此，途徑工程第一步的工作利用在廣泛而深入的研究中獲得的技術信息進行組合設計。

雖然生化代謝和細胞生理學理論為分析反應途徑提供了主要依據，但代謝流確定及其控制的研究結果具有更大的實用性。途徑工程最突出的特徵也許就是強調生化反應途徑與代謝流及其體內條件下的控制相關聯。將代謝流的定量分析方法與代謝流控制的分子生物學技術完美結合在一起，系統合理地修飾生物細胞的遺傳性狀，這是途徑工程的基石。在代謝途徑和代謝流的結構體系中，途徑工程的一個基本目標是闡明代謝流控制的因素和機制，對代謝流控制的全面理解是代謝途徑修飾的基礎。系統研究代謝流及其控制機制有三大基本步驟：第一，建立一種能儘可能多地觀察途徑並測定其流量的方法。為了做到這一點，通常從測定細胞外代謝物的濃度入手進行簡單的物料平衡。這裡必須強調的是，一個代謝途徑的代謝流並不等於該途徑中一個或多個酶的活性。事實上，酶法分析並不能提供途徑真正的代謝流信息，除非相應的酶在體外分析條件下存在並具有活性。在代謝分析中，酶法分析經常會錯誤地顯示相似數量級的代謝流，導致產生不正確的結論。第二，在生化代謝網絡中施加一個已知的擾動，以確定在系統鬆散之後達到新的穩態時的途徑代謝流。常採用的擾動方式包括啟動子的誘導、底物補加脈衝、特定碳源消除或物理因素變化等。雖然任何有效的擾動對代謝流的作用都是可以接受的，但擾動應該定位於緊鄰途徑節點的酶分子上。一種擾動往往能提供多個節點上的信息，這對於精確描述代謝網絡控制結構所必需的最小實驗量是至關重要的。第三，系統分析代謝流擾動的結果。如果某個代謝流的擾動對其下游代謝流未能造成可觀察的影響，那麼就可以認為該處的節點對上游擾動的反應是剛性（Rigid）的，與之相反的情況則稱為柔性（Fluxible）。在剛性節點處，試圖通過改變上游酶活性來影響下游代謝流的做法是徒勞的。

除了上述對代謝途徑的物質流和能量流進行分析之外，途徑工程的概念同樣適用於分析信息流，如信號轉導途徑等。隨着分子生物學研究的不斷深入，生物體內各種形式的信號轉導途徑作用機製得以闡明和積累，更進一步的意義在於合理設計、修飾甚至更換受體分子、信號分子、驛站分子以及基因表達調控的順式元件，構建嶄新的信號轉導途徑，最終形成途徑工程新的分支——信號轉導途徑工程。

途徑工程中的基因操作部分已經相當成熟，基因重組、克隆和表達的成功率在很大程度上依賴於生物材料與試劑。唯一值得研究的是重組DNA分子在目標生物體染色體上的整合機制、頻率以及整合子的遺傳穩定性，而後者又涉及到細胞生理代謝途徑的綜合平衡、外源基因表達程度與時段的調控設計、以及細胞對目標產物的耐受性等相關問題，因此是途徑工程應用的限制性因素。

研究意義

生物工程的學科體系建立在微生物學、遺傳學、生物化學和化學工程學的基本原理與技術之上，但其最古老的產業化應用可追溯到公元前40~30世紀期間的釀酒技術。二十世紀四十年代，抗生素製造業的出現被認為是微生物發酵技術成熟的標誌，同時也孕育了傳統生物工程的誕生。三十年之後，以分子遺傳學和分子生物學研究成果為理論基礎的基因工程技術則將生物工程引入了現代生物技術的高級發展階段。

生物工程與化學工程同屬化學產品生產技術，但兩者在基本原理、生產組織形式以及產品結構等方面均有本質的區別。在化學工業中，產品形成或者化學反應發生的基本場所是各種類型的物理反應器，在那裡反應物直接轉變成產物；而在生物技術產業中，生化反應往往發生在生物細胞內，作為反應物的底物按照預先編制好的代謝途徑反應程序，在催化劑酶的作用下形成最終產物。在此過程中，反應的速度和進程不僅僅依賴於底物和產物的濃度，而且更重要的是受到酶含量的控制，後者的變化又與細胞所處的環境條件和基因的表達狀態直接相關聯。雖然在一個典型的生物工程生產模式中，同樣需要使用被稱為細菌發酵罐或細胞培養罐的物理容器，但它們僅僅用於細胞的培養和維持，真正意義上的生物反應器卻是細胞本身。因此就生產方式而言，生物工程與化學工程的顯著區別在於：（1）生物工程通常需要兩種性質完全不同的反應器進行產品的生產，細胞實質上是一種特殊的微型生物反應器（Mircobioreactor）；（2）在一般生產過程中，微型反應器（細胞）的數量與質量隨物理反應器內的環境條件變化而變化，因此在物理反應器水平上施加的工藝和工程參數控制種類更多、程度更精細；（3）不僅如此，甚至每個微型反應器（細胞）內的生物催化劑的數量和質量也會增殖或跌宕，而且這種變化受制於更為複雜的機理，同時也遵循另一類代謝途徑所編制的固有程序，如酶編碼基因的表達調控程序、蛋白質的加工成熟程序、酶的活性結構轉換程序、以及蛋白質的降解程序等。如果考慮產品的結構，生物工程則不僅能生產生理活性和非活性分子，而且還能培育和製造生物活體組織。

發展發向

人工生物學研究的先驅、代謝工程專家傑伊·科斯林大膽預測：未來我們能夠使用隨手可得的、便宜的澱粉、蔗糖等設計和製造出一些可用來製備特殊化學產品的分子、細胞和微生物；代謝工程也將後來居上，超過並取代現在科學家用來製造藥品、塑料等的有機合成化學，成為化學工業的支柱。代謝工程：改造細胞的代謝途徑代謝工程是基因工程的延伸，即利用基因工程技術定向改造細胞的代謝途徑，以改善產物的形成和細胞的性能。基因工程通常只涉及少量基因的改造，比如將編碼某種蛋白藥物的單一基因轉入酵母，然後用該酵母發酵生產該藥物。但是，代謝工程會涉及大幅度的基因改變，比如，要在大腸桿菌中生產某種代謝產物如紫杉醇（尚在研究階段），就必須把一系列相關途徑的酶的基因全部導入大腸桿菌，並且敲除不必要和有害的大腸桿菌中原本就有的代謝通路，以構建出一整套大腸桿菌中原本沒有的紫杉醇的代謝途徑，使大腸桿菌能夠生產紫杉醇。科斯林是美國能源部下屬的聯合生物能源研究所（JBEI，美國能源部資助的三個生物能源研究中心中的一個，主要目的是推進下一代生物燃料的研發工作）的首席執行官；他也負責美國勞倫斯伯克利國家實驗室的生物科學研究項目；另外，他還是加州大學伯克利分校合成生物工程研究中心的負責人。科斯林表示，科學家可以通過將酶或不同宿主產生的代謝路徑結合進單個微生物中，同時通過對酶進行基因修改讓其具有新的功能來製造非天然的特殊化學物質、散裝化學物質和燃料。代謝工程未來的目標包括設計出能夠專門用於製造某些化學品和生產過程的分子和細胞。代謝工程產生青蒿酸在一篇發表於去年12月3日出版的《科學》雜誌的論文中，科斯林認為，作為現代生物技術主要的技術手段之一，代謝工程在使用微生物生產化學物質方面大有潛力，目前，這些化學物質主要由不可再生的能源或有限的自然資源來生產。2006年，科斯林在《自然》雜誌撰文指出，他和同事成功地使用代謝工程，用轉基因酵母合成了青蒿素的前體物質青蒿酸，新突破有望大幅增加青蒿素的產量，降低治療瘧疾的費用。此前，該小組曾將青蒿的一個基因植入大腸桿菌，利用細菌的生物合成過程獲得了一些中間物質，但這些物質還需要幾步反應才能生成青蒿酸。在最新研究中，研究人員在青蒿里發現了一種與青蒿酸合成有關的新酶，將製造這種酶的基因植入釀酒酵母后，酵母製造出了青蒿酸。在研究過程中，科斯林教授領導的小組還對有關代謝途徑作了重新設計，解決了天然或非天然代謝物大量積累對寄主的毒性問題，並對改造後的微生物用變異進化法進行優化篩選，最終將青蒿素合成的成本降低了10倍。此外，2008年，美國萊斯大學科學家報告稱，他們可以利用大腸桿菌發酵生產具有較高市場價值的甘油。以前的研究一直認為，在代謝途徑中可以產生1,3-丙二醇的細菌就可以發酵甘油，然而無論是大腸桿菌還是酵母菌都不能產生1,3-丙二醇。新研究揭示了以前未知的一條甘油發酵代謝途徑，利用與1,3-丙二醇類似的1,2-丙二醇來發酵甘油，而1,2-丙二醇可由大腸桿菌發酵產生。藉助代謝工程，用清潔環保、可再生生物燃料取代汽油和其他交通燃料也大有可能。目前，他和其在JBEI的研究團隊正在將代謝工程和有機合成化學方法結合起來，用木質纖維素類生物質人工合成液態交通燃料。製備散裝化學材料科斯林表示：「未來，代謝工程學將讓有機合成化學相形見絀。」他以製備藥物成分為例，在該領域，代謝工程的優勢明顯勝過有機合成化學。其中包括三類特定的化學物質——主要來源於植物的生物鹼、由不同細菌和真菌製造的聚酮化合物以及一般也由細菌製造的非核糖體多肽。科斯林認為，或許，未來代謝工程學最好的機會將是用於製造以石油為原料的散裝化學物質，包括汽油和其他燃料、聚合物以及溶劑等。因為這樣的產品能夠通過對石油進行催化而得到，所以，到現在為止，一直很少有人使用微生物來製備這些產品。但隨着油價飆升，以及考慮到資源緊缺和氣候變化等因素，現在這種情況已經發生了變化。他表示，現在，藉助代謝工程，人們可以使用成本低廉的澱粉、蔗糖或使用微生物作催化劑的纖維素生物質等原材料來製造這些化學物質。關鍵是，在代謝機制被修改過的細胞內製造出的這些化學物質，是目前產品所需要的準確分子，而不是一些「相同但更環保」、在使用之前還需經過廣泛測試的產品。面臨的障礙在其發表於《科學》雜誌的論文中，科斯林也提到了未來用新陳代謝工程學定製生產出微生物和分子所面臨的強大障礙，其中包括需要「調試程序」——發現和修復經過新陳代謝工程處理後的細胞中出現的錯誤。然而，他確信，這些障礙能夠也必將被克服。「我們能夠預見，在未來的某一天，不同的公司都能夠參與到細胞的製造過程中，每一家公司只專注於其中的一個方面，比如，有的公司構建染色體；有的公司組建細胞膜和細胞壁；有的公司則用激活細胞所需要的基本分子來填充細胞壁。」