Β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶（英語：β-galactosidase， β-gal或β-gal ）也稱為乳糖酶 ，是一種水解酶，催化β-半乳糖苷水解成單糖。使β-半乳糖苷酶作用的底物包括神經節苷脂GM1、乳糖苷、乳糖、各種糖蛋白。它可通過破壞糖苷鍵化將β-半乳糖苷水解為單醣。包括含有半乳糖的碳水化合物，其中糖苷鍵位於半乳糖分子上方。不同的β-半乳糖苷酶的底物包括神經節苷脂GM1，乳糖基神經酰胺，乳糖和各種糖蛋白。
目录
屬性與功能
人體必需的酶
β-半乳糖苷酶是人體必需的酶，它是一種外糖苷酶 ，專門水解在半乳糖和其有機部分之間的β- 糖苷鍵。它也可以裂解岩藻糖苷和阿拉伯糖苷，但效率低得多。蛋白質缺乏會導致半乳糖唾液酸中毒或Morquio B綜合症。在大腸桿菌中，lacZ基因是β-半乳糖苷酶的結構基因。它是可誘導系統lac操縱子的一部分，當葡萄糖水平低時，該操縱子在乳糖存在下被激活。 當葡萄糖水平足夠時，β-半乳糖苷酶的合成停止。
β-半乳糖苷酶具有基於相似序列的許多同源物。少數是進化的β-半乳糖苷酶（EBG），β-葡萄糖苷酶 ，6-磷酸-β-半乳糖苷酶，β-甘露糖苷酶和乳糖酶-蘆硫苷水解酶。 儘管它們在結構上可能相似，但是它們都有不同的功能。[“糖苷水解酶，家庭1，β-葡萄糖苷酶（IPR017736）<InterPro <EMBL-EBI”。www.ebi.ac.uk3]β-gal被L-核糖，非競爭性抑製劑 碘和競爭性抑製劑苯硫基-β-D-半乳糖苷（PETG），D-半乳糖內酯， 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）抑制 ，和半乳糖。
產生能量的關鍵提供者
β-半乳糖苷酶對生物很重要，因為它是產生能量的關鍵提供者，並且通過乳糖分解為半乳糖和葡萄糖而成為碳的來源。 這對於乳糖不耐症社區也很重要，因為它負責生產無乳糖的牛奶和其他乳製品。 許多成年人缺乏乳糖酶，該酶具有相同的β-gal功能，因此他們無法正確消化乳製品。 β-半乳糖用於酸奶，酸奶油和一些奶酪等乳製品中，經過酶處理後可以分解任何乳糖，然後再食用。 近年來，已經通過基因替代療法研究了β-半乳糖苷酶作為乳糖不耐症的潛在治療方法，可以將其放入人類DNA中，以便個人可以自行分解乳糖。
β-半乳糖苷酶，它也可能裂解岩藻糖和阿拉伯糖所形成的糖苷，但是效率比較低。 它是人體中所必需的酶。在此蛋白質不足的情況下可能導致Galactosialidosis(為一種溶酶體儲積病)或莫爾基奧乙綜合徵。在大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶的基因--lacZ的基因為誘導型系統的一部分，乳糖操縱子是於低血糖時在乳糖的存在下被激活。
監測基因表達的指標印記
分子生物學中經常使用β-半乳糖苷酶作為監測基因表達的指標印記。β-半乳糖苷酶也表現出藍/白篩選重組複製中稱之為α-互補形成的現象。這種酶可以分開為二種胜肽，分別為LacZ基因α和LacZΩ，這兩者自身分別都不是反應端，但是當兩者同時存在時，會自發地重新組合成一個有功能的酶。這個特性被利用在許多複製載體(克隆)，其中在有lacZα基因的質體表現可以將實驗室的大腸桿菌病株中的LacZΩ基因轉換為另一個突變基因。然而，當DNA片段插入到載體中，製作LacZα的被打亂，因此細胞沒有表現β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶活性表現的存在與否可透過X-gal的檢測來判斷，如果質體沒有插入此外來基因，就能成功表現出β-半乳糖苷酶的活性，就能成功分解X-gal，使菌落成為藍色。反之，插入外來基因的質體無法分解X-gal(因為β-半乳糖苷酶無法表現)，而成為白色的菌落。
1995年，由Dimri等人。提出了β-半乳糖苷酶具有在PH 6.0 的新亞型（衰退與β-半乳糖苷酶和SA-β-半乳糖苷酶(衰老)有關）這被拿來特別表達老化（細胞的不可逆的生長停滯）。具體的定量測定法甚至開發了他的感應檢測。 然而現在已經知道，這是溶酶體內源β-半乳糖苷酶的積累，而使其過度表現不需要的衰老。儘管如此，它仍然是最廣泛使用在衰老以及衰好細胞的生物標記物，因為它具有相當可靠的和容易檢測之特性。
結構
大腸桿菌1024個胺基酸中的β-半乳糖苷酶最初是在1970定序出來，而其結構是在24年後，也就是1994年確定該蛋白是一個464 - kDa的 同源四聚體與2,2,2點對稱性且每個單元的β-半乳糖苷酶包括了五個領域 ; 第一區域是膠卷型桶，第二區域和第四區域為纖連蛋白III型狀的桶，第五區域是β-三明治型，而中央的第三區域是TIM型桶。
活性端位於第三個結構域。活性端是由四聚體兩個亞基的元素所組成的，並且在四聚成二聚體活性端的解離除去中的扮演關鍵要素。β-半乳糖苷酶的末端序列中，α-肽參與了於亞基介面中的的α-互補。其殘基22-31幫助以穩定的四螺旋束形成該界面的主要結構，殘基13和15則有助於激活接口。這些結構上的特徵為為α-互補的現象，為缺失的氨基末端片段的結果在非活性二聚體的形成提供一個合理的解釋。
大腸桿菌 β-半乳糖苷酶的1,024 個氨基酸於1970年首次測序 ，其結構在24年後的1994年確定。該蛋白是具有2,2,2-點對稱性的464 kDa同型四聚體 。β-半乳糖苷酶的每個單元均由五個結構域組成； 域1是果凍卷式桶 ，域2和4是纖連蛋白III型桶，域5是β三明治，而中央域3是TIM型桶 。
第三個域包含活動站點。活性位點由四聚體兩個亞基中的元素組成，四聚體解離成二聚體可去除活性位點的關鍵元素。 β-半乳糖苷酶（參與α-補體的α-肽）的氨基末端序列參與亞基界面。 其殘基22-31有助於穩定形成該界面主要部分的四螺旋束，而殘基13和15也有助於活化界面。 這些結構特徵為α-互補現象提供了理論依據，其中氨基末端區段的缺失導致無活性二聚體的形成。
催化反應
β-半乳糖苷酶的活性端通過「淺層」與「深層」結合基質來催化水解雙糖。一價的鉀離子（K+），以及二價的鎂離子（鎂2+）需要酶的最佳活性。以β-核苷間鍵為基質經由穀氨酸側鏈上的羧基終端裂解而成。 在大腸桿菌中，穀氨酸-461被認為是取代反應的親核試劑。然而，現在已經知道穀氨酸-461是一種酸[催化劑]。相反的，穀氨酸-537為實際的親核試劑，他是結合到半乳糖的中間體。
在人類中，是由Glu-268扮演水解反應的親合試劑。
應用
β-半乳糖苷酶檢測常用於遺傳學、分子生物學，以及其他生命科學。可用於藍/白篩檢測中，有活性的酶可以用X-gal來進行檢測，會在裂解β-半乳糖苷後形成一個深藍色的產物5-溴-4-淀藍，並且容易辨識和量化。它的生產可以透過非水解性誘導結構異構物中的異乳糖─IPTG，從lac操作者中結合並釋放lac操縱子，從而使轉錄起始端繼續進行。
因為他的高表現性質以及它在衰老細胞中的溶酶體累積的特性。儘管有其局限性，它可被當作一個老化的標誌物，藉由進行體內和體外在定性和定量可用以測定老化程度。
反應
β-半乳糖苷酶可以催化生物體中的兩種不同反應。 在一個過程中，它可以經歷一個稱為反式半乳糖基化反應的過程，以製造半乳糖 ，從而為β-gal的產生創造一個正反饋迴路 。 它還可以將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，然後進行糖酵解。β-半乳糖苷酶的活性位點通過“淺”（非生產位點）和“深度”（生產位點）結合催化其二糖底物的水解。 當酶處於“開放”構象時， 半乳糖苷（例如PETG和IPTG）將結合在淺位點，而當“閉合”構象時，過渡態類似物（例如L-核糖和D-半內酯內酯）將結合在深位點。酶促反應包括兩個化學步驟，半乳糖基化（k2 ）和半乳糖基化（k3）。半乳糖基化是反應中的第一個化學步驟，其中Glu461將質子提供給糖苷氧，導致半乳糖與Glu537共價鍵合。 在第二個步驟中，半乳糖基化，當Glu461接受質子時，共價鍵斷裂，用水代替半乳糖。 在每個步驟之後，在反應過程中，酶的深位會出現兩個過渡態。當水參與反應時，形成半乳糖，否則，當D-葡萄糖在第二步驟中充當受體時，發生轉半乳糖基化。動力學測定該蛋白質的單個四聚體以每分鐘38,500±900個反應的速率催化反應。單價鉀離子 （K+）和二價鎂離子（Mg 2+ ）是該酶最佳活性所必需的。底物的β鍵被谷氨酸 側鏈上的末端羧基裂解。
在大腸桿菌中 ，Glu-461被認為是取代反應中的親核試劑 。然而，現在已知Glu-461是酸催化劑。相反，Glu-537是實際的親核試劑，與半乳糖基中間體結合。在人類中，水解反應的親核試劑是Glu-268。Gly794對β-gal活性很重要。它負責將酶置於“封閉”，配體結合，構象或“開放”構象，對活性位點環起“鉸鏈”的作用。 不同的構象確保僅優先結合發生在活性位點。在慢的底物存在下，Gly794活性增加以及半乳糖基化的增加和半乳糖基化的減少。
使用
β-半乳糖苷酶測定法經常用於遺傳學 ，分子生物學和其他生命科學中 。可以使用人工顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷X-gal來檢測活性酶。β-半乳糖苷酶將切割X-gal中的糖苷鍵並形成半乳糖和5-溴-4-氯-3-羥基吲哚，後者會二聚並氧化為5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo，易於識別和量化的藍色產品。例如用於藍白色屏幕 。它的產生可能是由半乳糖的非水解類似物 IPTG誘導的，該類似物與lac操縱子結合併釋放lac阻遏物，從而使轉錄的啟動得以進行。
它在分子生物學中通常用作報告基因標記，以監測基因表達。它還表現出稱為α-互補的現象，該現象構成了重組克隆藍/白篩選的基礎。 該酶可以分為兩個肽，LacZα和LacZΩ，它們都不具有活性，但是當兩者同時存在時，會自發重組為功能性酶。 在許多克隆載體中利用了這種特性，在質粒中lacZα基因的存在可以反演在大腸桿菌特定實驗室菌株中反編碼LacZΩ的另一個突變基因。 然而，當將DNA片段插入載體中時，LacZα的產生被破壞，因此細胞沒有顯示出β-半乳糖苷酶活性。可以通過X-gal檢測活性β-半乳糖苷酶的存在與否，當被β-半乳糖苷酶切割時會產生特徵性的藍色染料，從而提供了一種簡便的方法來區分質粒中克隆產物的存在與否。在對白血病染色體易位的研究中，Dobson及其同事在小鼠中使用了LacZ融合蛋白，利用β-半乳糖苷酶的寡聚趨勢，暗示寡聚性在MLL融合蛋白功能中的潛在作用。
1995年，Dimri等人。 有人提出了一種新的β-半乳糖苷酶同工型，在pH 6.0下具有最佳活性（衰老相關的β-gal或SA-β-gal ），將在衰老中特異性表達（細胞的不可逆生長停滯） [1]。甚至開發了專門的定量檢測方法進行檢測。但是，現在知道這是由於溶酶體內源性β-半乳糖苷酶的過表達和積累引起的，衰老不需要其表達。 然而，由於它可靠且易於檢測，因此它仍然是衰老和衰老細胞中使用最廣泛的生物標記。
進化的β-半乳糖苷酶
某些細菌（包括大腸桿菌 ）還具有其他β-半乳糖苷酶基因。 將lacZ基因缺失（但仍含有半乳糖苷通透酶基因lacY ）的菌株接種到含有乳糖（或其他3-半乳糖苷）的培養基中時，發現了第二個基因，稱為進化β-半乳糖苷酶（ ebgA ）基因。碳源。 一段時間後，某些殖民地開始增長。 但是，EbgA蛋白是無效的乳糖酶，不允許在乳糖上生長。 兩類單點突變可顯著提高ebg酶對乳糖的活性。因此，突變酶能夠替代lacZβ-半乳糖苷酶[2]。EbgA和LacZ在DNA水平上是50％相同，在氨基酸水平上是33％相同。活性ebg酶是ebgA基因和ebgC基因產物的1：1比率的聚集體，ebg酶的活性形式是α4β4雜八聚體。
視頻
參考資料
- ↑ 一種生物標記物，可在培養物中和體內衰老的皮膚中識別衰老的人類細胞程序Natl/美國科學學院
- ↑ 在大腸桿菌中發展新的乳糖酶功能所需的突變數細菌學雜誌