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 酶切

 

 

 

酶切是對粘末端的DNA分子和載體分子進行切割,以獲得相應的粘末端連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單,雙酶切困難。

定義

酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單,但雙酶切如果兩種酶所用緩衝液成分不同(主要是鹽離子濃度不同)或反應溫度不同,這時可以採用如下措施解決:1)先用一種酶切,然後乙醇沉澱回收DNA分子後再用另外一種酶切;2)先進行低鹽要求的酶酶切,然後添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求,加入第二種酶進行酶切;3)使用通用緩衝液進行雙酶切。具體要根據酶的反應要求進行,儘量避免活力損失。

步驟

一、實驗材料準備

1. 材料:質粒DNA。

2. 試劑:限制性內切酶、ddH2O。

3 . 儀器:微量移液槍,離心機,水浴鍋, 電泳儀,紫外透射觀測儀。

二、單酶切

1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入:

(1)質粒DNA:X μL(約1 μg)。

(2)限制性內切酶:1 μL(約10 U)。

(3)10×buffer:2 μL。

(4)ddH2O:補足20 μL。

2. 混勻,做好標記。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 min中止反應。

5. 電泳檢測酶切效果。

三、雙酶切

1. 在1.5 mL滅菌離心管中依次加入:

(1)質粒DNA:X μL(約1 μg)。

(2)限制性內切酶1:1 μL(約10 U)。

(3)限制性內切酶2:1 μL(約10 U)

(3)10×buffer:1或2 μL。

(4)ddH2O:補足20 μL。

2. 混勻,做好標記。

3. 37℃水浴1-3 h。

4. 70℃水浴10 min中止反應。

5. 電泳檢測酶切效果。

四、結果與分析

假若一種酶在環狀質粒DNA中只有一個酶切位點, 且酶切徹底,紫外燈下檢測電泳結果,則單酶切應為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多於理論值,那麼有可能是酶切不完全。如果酶切結果與酶切前的質粒條帶一樣(超螺旋、線性和開環三條帶),則說明質粒完全沒有被切開。[1]

參考文獻