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原圖鏈接世界種業網

轉基因魚中科院水生生物研究所魚類轉基因工程組的科學家們，在朱作言院士的領導下，將草魚的生長激素基因注入鯉魚的受精卵，培育出一種帶有草魚生長激素基因的轉基因鯉魚F1代和另一種具有草魚生長激素基因的轉基因三倍體鯉魚「吉鯉」。

繁殖方法

顯微注射法

顯微注射法是廣泛使用、效果較好的一種魚類基因導人方法，其主要程序如下：(1)人工催情，分別收集魚的卵子和精液，體外人工受精；(2)受精後3～5min，用0．25%的胰蛋白酶消耗以去除卵殼，將裸卵移入盛有Holtfreter氏培養液的平面皿中；(3)將溶於ST(88mMNaCl、10mMTris—HCl，pH7．5)溶液中的外源基因裝人玻璃微針，在第一次卵裂前實施外源基因的顯微注射手術。每卵注射1—2nL的DNA溶液，約含1×106拷貝的外源基因；(4)顯微注射後，受體卵在Holffreter氏溶液中培養發育。胚胎髮育至原腸期後，將培養液逐漸用暴氣的冷開水稀釋；發育至心跳期後，將胚胎轉移到暴氣的冷開水中直至形成魚苗。在胚胎髮育過程中，需精心管理，及時去除死胚胎。

上述方法主要適用於一些卵殼易被胰蛋白酶消化的淡水鯉科魚類。對於一些冷水性的鮭鱒魚類來說，胰蛋白酶消化難以去除卵殼。因此發展了3種變通的顯微注射方法。一是從受精孔將DNA溶液注入卵中，簡稱MP法；二是在虹鱒受精卵剛受精後卵殼尚未變硬時直接注射，簡稱EL法；三是先用硬金屬針在卵殼上打一個孔，再進行顯微注射，簡稱LI法。

電脈衝法

電脈衝進行魚類受精卵基因轉移的前兩步與顯微注射法相同。不同的是將胰酶消化後的裸卵與外源DNA溶液一同放人一特製的電脈衝處理槽中，然後施加一定強度的電脈衝。外源DN在電脈衝處理下進入受精卵。這一方法的優點是操作比較簡單，可同時處理大量的受精卵。缺點是導人無定向、效率較低，針對不同種魚需要建立相應的電脈衝條件等。

外源基因在電脈衝處理條件下進入受精卵的機制尚不十分清楚。在已成功的魚類電脈衝基因轉移報道中，使用的電壓都較低(幾百伏)。有人認為，在這樣的電壓下，不足以使受精卵膜發生變態或產生小孔。因此，外源基因的進入機制也就不同於培養細胞，推測是在魚類受精膜上天然存在一些小孔，在低電壓下，外源基因就通過這些小孔進入受精卵。

精子攜帶法

精子在等滲液中先與外源基因保溫，可將外源DNA片段帶人精子細胞內，再與卵子受精，可將外源DNA片段帶人受精卵內。該方法簡單、方便，依靠生理作用受精，對原核損害較小。此法已在鯉魚、泥鰍[5l中試驗成功，已有6種魚的成功報道。其外源基因的處理方法雖各有不同，但都得到分子雜交或PCR檢測的陽性結果，陽性率在5%～38%。從總的實驗結果來看，精子攜帶基因轉移尚存在轉基因陽性率低、轉移率不穩定現象。此外，精子攜帶外源基因的機制尚未明確，推測與精子表面吸附或精子細胞攝取有關。

基因槍注射法

基因槍注射法是通過把吸附DNA的金屬微粒高速打人細胞內，使基因導入細胞內的方法。有人在泥鰍、斑馬魚、鮭魚的3日胚上應用此法，結果70%的個體生存，一部分個體導入了外源基因。此法不容易進行，但有短期可處理多個個體的優點，只是報道太少，有待今後進一步的研究。

逆轉錄病毒感染法

此類病毒是RNA病毒的一種，進入宿主後從RNA逆轉錄成DNA，並結合到宿主細胞的染色體上，這種納入病毒基因的細胞染色體內就存在了病毒基因。如果把目的基因組合到病毒染色體上，用改造的病毒侵染宿主細胞就有可能向細胞內導人外源基因17J。但轉基因因病毒有嚴格的宿主特異性，而且魚類轉基因病毒的分析非常落後，對於魚類此法暫不太適用。

組織注射法

有報道外源基因向體組織直接注射時，周圍細胞把外源基因納人，並且發現了那種外源基因。有人把CAT(鏈黴素轉移酶基因)注射到一些魚的體側肌肉上，從肌肉勻漿中檢測出CAT活性」。另一方面，把含有合成黑色素的互補DAN質粒注射到一些魚的體側肌肉上，使周圍體表合成黑色素，體表黑化。這種方法能非常容易地把外源基因導人細胞內，所以對檢測外源基因啟動子非常有效。

卵母細胞的基因轉移

選取、收集、準備發育到一定時期的卵母細胞，顯微鏡下檢查胚泡，若卵可供注射，操縱注射管，扎進胚泡進行顯微注射，即將外源基因準確地注入卵母細胞核中，離體培養卵細胞至成熟卵，然後與正常精於受精，使受精卵整合外源基因，發育成轉基因魚。

基因打靶法

20世紀90年代出現了新的外源基因導入技術，即基因剔除(gene knock out)和基因楔入(geneknockin)技術。基因剔除是基因打靶的(genetargeting)一種方法，類似於同源重組技術，指外源DNA與受體細胞基因組合，這是一種先進的傳染技術，克服了其它傳染技術無法消除的盲目性和偶然性，具有整合位點確定、精確、轉移基因頻率較高等優勢，但是基因剔除技術不能產生核苷酸水平上的精確突變，新的挑戰使條件性基因剔除(conditional gene knock out)應運而生，這是基因剔除技術的一個飛躍。它是指在某一特定的細胞類型或細胞發育的特定階段剔除某一特定基因的技術，常採用打了就走(hit and runstrategy)、標記—交換(tag and exchange strategy)和Cre—10tP重組系統(Cre—Lot P recombina-tion system)等新的轉基因策略，這些新策略可對細胞中任一基因進行核苷酸水平上的精確突變。

基因楔入又稱基因置轉技術(gene replace·menttechnique)，使雙鏈的斷裂點發生在同源序列的邊緣或同源序列之外，轉基因的結果是外源DNA取代內源靶序列，雖然基因楔人技術剛剛起步，但已經展示了它在應用研究方面的廣闊前景。以上介紹的幾種基因打靶方法大大提高了外源基因的整合率，但是未能解決外源基因定點整合的問題。小鼠ES細胞基因打靶技術可以獲得對某一位點上基因進行改造的同合子個體。該技術首先把含有更改好的基因或基因的一部分插入到載體，並引入來自小鼠的ES細胞系，ES細胞能進行組織培養，並能產生任何組織的細胞，細胞增殖一段時間後，篩選出發生同源重組的少數細胞進行克隆並擴增，然後用顯微毛細管將細胞注入小鼠早期胚胎，產生嵌合體。若該嵌合體在生殖細胞攜帶外源基因，則其後代中1/2為轉基因個體，它們相互交配，後代中1/4為攜帶外源基因的同合子，即為可用於研究的轉基因個體。然而該技術的應用必須依賴於ES細胞，而ES細胞只能在小鼠上獲得，故該技術只能局限在小鼠上展開。如何在大動物上做到外源基因的定點整合是研究人員一直努力的方向。

形態特徵

轉基因鯉魚F1代是由黃河鯉和草魚生長激素基因組成的轉「全魚」基因魚，它150天可長至1200克，最大可達2000克；兩年可達5000克。它的生長速度比普通鯉魚快140%以上。

吉鯉是由轉基因兩倍體鯉魚與轉基因四倍體魚（兩套鯉魚染色體，兩套鯽魚染色體）結合而培育出無生育能力的吉鯉。吉鯉具有草魚的生長快優點，又具有鯽魚的味道。由於它不能生育，因而在推廣過程中不存在與其它魚類雜交引起生態危機之憂。

轉基因魚的生物安全性包括食品安全性、生態和遺傳安全性。普通公認的轉基因食品安全性評價原則是1993年歐洲經濟發展合作組織（OECD）提出的「實質等同性」原則，即轉基因食品及食品成份是否與市場上銷售的傳統食品具實質等同性。

轉「全魚」基因黃河鯉所轉植的外源基因為一個與鯉魚內源生長激素基因十分相似的草魚生長激素基因。將草魚生長激素基因轉移到鯉魚身上，對鯉魚來說是安全的；與傳統養殖的鯉魚相比，轉「全魚」基因黃河鯉攜帶有草魚生長激素基因，體內含有非常微量的草魚生長激素。草魚生長激素和鯉魚生長激素一樣，為魚體內本來就存在的一種極不穩定的多肽，經過加熱等物理處理後被分解為氨基酸，失去其激素的生理功能，和非轉基因鯉魚一樣具有食用安全性。

轉「全魚」基因魚商品化養殖後，是否會對魚類種質資源和水生態環境產生影響？我們不妨把「全魚」基因轉移視為一種「雜交」，即一個基因與一個物種基因組的雜交。魚類的基因組大約有10萬個基因。轉「全魚」基因黃河鯉的形成機制可簡單地比作一個草魚基因與10萬個鯉魚基因的雜合。物種的雜合程度僅為草魚與鯉魚雜交的十萬分之一。從這一點分析，轉基因魚比起任何雜交魚要安全得多，再則，轉基因魚的繁殖能力和對環境的適應性均不占優勢，即使讓它進入大自然，它也不可能形成優勢種群，抑制其它魚類生長，對生態系統造成威脅。而且，轉基因魚帶有的草魚基因僅是草魚的十萬個基因片斷之一，即使它能與其它魚類進行雜交，所造成的基因混亂的可能性也很小。

魚類是研究轉基因動物的良好材料，由於1尾雌魚能提供成千上萬個卵，卵的體積也很大，且它們在體外受精和體外發育，胚胎操作較哺乳類簡單。因此，繼朱作言等獲得第一批轉基因魚以來，世界上已有幾十個實驗室先後開展了這方面的研究，並取得了相當大的成就。轉基因魚是國內外獲得的最成功的轉基因動物之一。

存在問題

外源基因的分離、定點整合和表達

在現有的轉基因魚中，供體基因基本上都是來自哺乳類的BH基因rloI。根據生物本身的特性，大分子尤其是蛋白質分子在種屬上均具有特異性。因此，在轉基因研究中應儘量考慮供體和受體魚之間的親緣關係。加強主要養殖魚類抗逆、抗病基因的分離工作。外源基因導人受精卵後，其整合率與基因操作技術有關，而整合率高低決定外源基因能否穩定遺傳。此外，外源墓因能否在受體細胞中高效表達，啟動子和增強子起很大的作用，特定基因的啟動子其功能具有組織特異性，增強子具有種的特異性。如果能從魚類的基因組中分離出合適的啟動子，則可能會獲得更有效的表達。

顯微注射法

在魚類基因轉移中比其它方法導入的外源基因整合率要高，但工作量非常大，對於季節性產卵的魚類，注射魚卵數有限，且很多胚胎夭折，在存活的魚苗中，相當一部分不能發生整合，為後續的篩選帶來諸多不便。電脈衝法、精子攜帶法等高效轉基因方法，整合率又非常低，更待進一步完善。檢測外源摹因整合率一般均使用斑點雜交和Southern印跡法。這種方法需要很貴重的生物藥品和酶類，且使用放射性同位素標記，代價高，耗時長，且有礙人體健康。如能憑藉魚苗早期 階段的形態、花色等標記分出轉基因魚，及早淘汰非轉基因魚，將是轉基因魚研究的得力方法。

環境問題

轉基因魚進人大自然，對生態平衡將會造成不同程度的影響。許多科學家認為，轉基因魚的表型可能有3個方面改變，即生理節律性、對環境忍受力和行為。這些表型的改變必定破壞現有的良性生態平衡。此外，轉基因魚使用的啟動子多為mMT，該啟動子在許多運動組織中均誘發重金屬離子的積累，人若長期食用這種轉基因魚，便會造成重金屬中毒，這也必須予以重視。

篩選及品系建立

轉墓因魚研究的目的是要獲得經濟價值高的轉基因魚品系供生產應用。轉基因魚經過DNA水平、蛋白質水平以及宏觀生長對比和生物學試驗觀察確定後，需要有一個快速建立優良品系的方法，通常所用的是單性發育方法。理論上，經過二代單性發育，優良的遺傳性狀即能固定下來，形成新品系。但實際工作並非如此簡單，因為外源基因在受體魚生殖細胞傳遞中，受到化學修飾，封閉基因的表達，及外源基因進入受體細胞後的甲基化問題等，都將影響轉基因魚品系的建立。

批准上市

2013年11月25日，在加拿大政府批准一種可食用轉基因魚上市後，美國對這種魚類的審批工作也已經進入最後階段，這種轉基因大馬哈魚或成美國通過的首個轉基因動物食品。這種經過基因改造的大馬哈魚採用了大洋鱈魚、王鮭等基因，比野生或養殖同類生長速度快一倍。

總部位於加拿大的AquaBounty公司正尋找投資者，該公司已經獲得加拿大政府許可證，可在加拿大愛德華王子島工廠中生產轉基因大馬哈魚卵。這些魚卵將被運往巴拿馬西部內陸漁場，在遠離河流與海洋的巨大金屬箱中長大。隨後這些魚將被冰凍起來，送往世界各地。