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蛋白质体外定向进化

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蛋白质体外定向进化指的是通过各种实验技术,在体外模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择),通过突变和重组一个或多个亲本使基因发生变异,再通过对特定酶的特定功能或性质进行筛选,定向选择有价值的非天然蛋白分子。因而本质上,体外定向进化是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。

研究背景

1859 年，达尔文在《物种起源》中提出了生物进化论学说，揭示了生物在遗传、变异、生存斗争和自然选择中是不断发展变化的．近代生物学的发展使人们认识到蛋白质进化大多是由于某些点突变或修饰的积累，而在自然条件下，蛋白质性质或功能的改变通常需要很长时间．早期人们采取了各种诱变手段以期能够对蛋白质性能进行改造，如最早在1982 年，Winter 等报道了通过基因定位诱变获得改进的酪氨酸tRNA 合成酶．1983 年，Ulmer 在《科学》(Science) 上提出蛋白质工程(protein engineering)一词，指按照人们的需求，通过对蛋白质信息和功能的分析，设计改造蛋白质分子．但当人们试图基于蛋白质结构对其进行改造时，由于结构生物信息的匮乏以及蛋白质结构的复杂性，合理设计进行得十分困难，蛋白质工程的发展受到了严重制约。

蛋白质体外定向进化的发展拓宽了蛋白质工程的设计范围，可在未知目标蛋白质结构信息和作用机制的情况下对蛋白质进行改造。蛋白质体外定向进化发展初期，科学家主要将其用于筛选和控制(或影响)所需表型．20 世纪中期，蛋白质体外定向进化被引入实验室用于再现和研究自然进化进程．近年，定向进化更多地被用来改善蛋白质性能，改进蛋白质药物的稳定性、半衰期、免疫原性，开发酶的新底物利用以及改进或拓展新的代谢途径等。最近的研究表明，蛋白质体外定向进化被成功地应用在代谢途径的关键酶设计、新底物催化功能的开发、创造全新功能蛋白质以及筛选和鉴别预期功能蛋白质中，在代谢工程和合成生物学领域发挥了重要作用

主要方法

在体外分子定向进化策略中,两个最关键的环节是构建目的基因的突变体库和对不同突变基因表达的蛋白进行筛选。在构建分子多样性最广泛的突变体文库方面,通常采用的方法是随机突变和体外重组。在定向进化的实践中,对不同的目标基因通常应选择合适的方法,也可以将二者结合起来运用。目前常用的技术有易错PCR、DNA改组、交错延伸重组、体外随机引发重组等 [2-3] 。

易错PCR

易错PCR （error-prone PCR） 是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配， 导致目的基因随机突变， 然而， 经过一次突变的基因很难获得满意的结果， 由此发展出连续易错PCR （sequential

errorpronePCR）， 它是将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板， 连续反复的进行随机诱变， 使每一次获得的小突变累计而产生重要的有益突变。

在该方法中， 遗传变化只发生在单一分子内部， 属于无性进化（asexual evolution）， 和其他进化方法相比较， 它消耗精力和时间， 一般适合较小的基因片段（<800 bp）， 另外该方法还容易出现碱基转换现象。

DNA改组和外显子改组

DNA改组（DNA shuffling） 又称有性PCR（sexualPCR），是将一群密切相关的序列（如多种同源而有差异的基因或一组突变基因文库） 在DNase I的作用下随机酶切成小片段， 这些小片段之间有部分的碱基序列重叠， 它们通过自身引导PCR延伸，并重新组装成全长的基因。该方法的主要目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会， 导致更大的突变， 最终获得最佳突变组合的酶。在理论和实践上它都优越于“寡核苷酸引导的突变” 和“连续易错PCR”， 通过DNA改组， 不仅可以加速积累有益突变， 而且还可使酶的两个或更多的优化性质合为一体。外显子改组(exon shuffling) 类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段之间进行交换， 它特别适合于真核生物， 自然界中不同分子的外显子发生同源重组， 导致不同外显子结合， 是产生新蛋白的重要途径之一。

杂合酶

杂合酶（hybrid enzyme） 是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、结构域） 或整个酶分子进行组合和交换， 以产生具有所需性质的酶杂合体。杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质， 是了解酶的结构和功能以及相关酶的结构特征的有力工具， 它还可以扩大天然酶的潜在应用， 甚至可以产生催化自然界不存在的新酶分子。

体外随机引发重组

体外随机引发重组（random-priming in vitrorecombination， RPR）， 以单链DNA为模板， 配合一套随机引物， 先产生大量互补于模板不同位点的短DNA 片段， 由于碱基的错配和错误引发， 这些短DNA 片段中也会有少量的点突变， 在随后的PCR反应中， 它们互为引物进行合成， 伴随组合， 再组装成完整的基因长度。[8]如果需要， 可反复进行上述过程， 直到获得满意的进化酶性质。该法优于DNA 改组法的特点在于： （1） RPR 可以利用单链DNA为模板， 故可10～20倍地降低亲本DNA量；

（2） 在DNA 改组中， 片段重新组装前必须彻底除去DNaseⅠ， 故RPR 方法更简单；

（3） 合成的随机引物具有同样长度， 无顺序倾向性， 并且在理论上， PCR 扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变；

（4） 随机引发的DNA合成不受DNA 模板长度的限制。

交错延伸

交错延伸(stagger extension process， StEP) 原理的核心是在PCR 反应中把常规的退火和延伸合并为一步， 并大大缩短其反应时间(55℃， 5s)， 从而只能合成出非常短的新生链， 经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行， 直到产生完整的基因长度， 结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。StEP 法重组发生在单一试管中， 不需分离亲本DNA 和产生的重组DNA。它采用的是变换模板机制， 这正是逆转录病毒所采用的进化过程。该法简便且有效， 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具。

过渡模板随机嵌合生长

过渡模板随机嵌合生长(random chimeragenesis on transient templates,RACHITT)是概念上与DNA改组明显不同的、改进的基因家族重组技术,不包括热循环、链转移或交错延伸反应。其原理是将原始基因的一条单链随机切成小片段，通过退火杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接,从而合成全长基因序列。该方法与传统的DNA改组相比,其优势在于它的高频率、高密度重组频率,并可在短至5 bp的序列同一区内产生交叉，比DNA改组方法高出几倍,因而更具应用价值。

应用

蛋白质体外定向进化大大加速了人类改造蛋白质原有功能和开发新功能的步伐。其广泛应用在与工业相关的催化酶方面, 主要体现在以下几方面：(1) 提高酶的活性；(2)提高酶的热稳定性；(3) 改变酶的底物特异性；(4) 创建新型蛋白酶

改善酶催化效率

蛋白质体外定向进化可以有效地提高酶活性、解除抑制作用。2012 年，有报导利用epPCR 方法对植酸酶进行进化后，与出发菌相比，突变酶的比活力增强了61%，酶与底物亲和力增加了53%，催化效率提高了84%。同时有研究者将蛋白质分子动力学与定向进化结合，在统计天冬氨酸激酶(AK3)家族的序列信息后，确定了与天冬氨酸激酶运动和耦合作用相关的残基．随后对这些残基进行点突变，新得到了12 个对赖氨酸抑制效果不敏感的AK3 突变株，以及6 株减弱了天冬氨酸脱氢酶Ⅰ- 高丝氨酸脱氢酶(AK1-HD1)变构抑制作用的突变株．

提高酶稳定性

蛋白酶的稳定性主要体现在对pH 值的稳定性和热稳定性两方面，其对生物催化效率有着重要影响．酶稳定性的提高是蛋白质体外定向进化的重要应用之一。有研究者为获得耐酸性的地衣芽孢杆菌α- 淀粉酶(BLA)，利用epPCR 对BLA 进行了定向进化，并得到了两个重要的突变位点：T353I 和H400R．相比较与野生菌株，单一位点突变株Thr353Ile、His400Arg 以及双位点突变株Thr353Ile/His400Arg 在pH 4.5 的条件下的Kcat/Km值分别提高了3.5 倍、6.0 倍和11.3 倍， 且Thr353Ile/His400Arg 突变株更耐受低pH 条件，同时其热稳定性没有明显改变。

改变底物特异性

木糖是自然界中第二大丰富的可再生能源，利用木糖发酵生产乙醇有重大的经济潜能，但主要用于生产乙醇的酿酒酵母不能够有效利用木糖．将树干毕赤酵母中的木糖还原酶(PsXR)和木糖醇脱氢酶(PsXDH)引入酿酒酵母，经过两步氧化还原反应可以使木糖转变为木酮糖，从而被利用．但由于PsXR 和PsXDH 均特异性依赖NADPH，因此这种改造导致了细胞内还原力不平衡，降低了乙醇得率并生成大量副产物木糖醇．为消除胞内的氧化还原不平衡，人们试图将依赖NADPH 的PsXR 和PsXDH 改造为NADH 依赖性。PsXDH 的底物特异性改造取得了一定的效果，而对PsXR 的改造没有显著效果

创造新型催化活性蛋白酶

随着合成生物学的快速发展，设计目标生物体性状，甚至构建新型蛋白质成为了蛋白质体外定向进化的重要发展方向。乙二醛酶Ⅱ是乙二醛酶系统的重要组成部分，催化S-D- 乳酰谷胱甘肽水解生成D- 乳酸和谷胱甘肽，其在结构上与其他金属水解酶如β 内酰胺酶以及芳基硫酸酯酶水解酶有相似之处．为在现有的蛋白支架上改变酶的催化活性，研究者同时对金属水解酶的催化活性位点和结合位点进行了分析，并对其活性位点的环状区域进行了碱基的插入或删除，从而将β 内酰胺酶活性引入到了乙二醛酶Ⅱ的αβ/βα 金属水解酶支架上．最终得到的进化蛋白evMBL8 完全不表现水解酶活性，但具有β 内酰胺酶活性，且其催化头孢噻肟水解的(Kcat/Km)app值为每秒1.8×102 mol/L，表达evMBL8 的E. coli对头孢噻肟的耐药性提高了100 倍．尽管evMBL8的β 内酰胺酶活性低于天然β 内酰胺酶，但此案例仍成功显示了蛋白质新功能可以通过定向进化的方法获得。除此之外，蛋白质体外定向进化不仅能够成功构建酶的新型催化功能，还可以获得非天然的催化反应，如催化具有非天然底物的反应等。且结合蛋白质随机进化策略可以进一步提高其催化效率。

理论意义

蛋白质体外定向进化在医药业、农业上也产生了巨大影响。重组蛋白质药物在药品中占有重要地位,其主要产品有细胞因子、生长因子和酶。通常情况下,许多这类产品有副作用, 可以引起严重的并发症,或者使用时有条件限制, 因而不利于广泛应用。用蛋白质体外定向进化技术可以选择性改造这些产品的基因, 获取所需的性质,排除不利的活性。

定向进化不仅在工业、医疗方面对蛋白质的改造具有重要的意义, 而且, 它也非常适合于基础理论的研究。对蛋白质分子进化得到的突变体进行分析, 为研究蛋白质的结构和功能的关系提供了新的工具。天然蛋白质序列中往往有很多是随机遗传漂移, 而不是功能性的适应。例如, 从适应不同环境的物种中提取出的蛋白质经常有几十个氨基酸的不同, 其中只有一小部分是与特定功能差异有关的。大量的中性突变只能干扰科学家辨别分子的规律。在实验室的进化实验中, 种系很清楚, 而且突变主要是适应性的。通过定向进化来研究蛋白质的结构和功能的关系,可为蛋白质的理性设计提供理论依据