病毒包装查看源代码讨论查看历史
| 病毒包装 |
病毒包装，外文名Virus packaging，是一种基因诊断、基因治疗技术。
基本信息
中文名称; 病毒包装
外文名称; Virus packaging
随着; 分子生物学的理论及技术方法
构建; 各种载体、克隆及分析目标基因
诞生了; 基因诊断、基因治疗技术
应用领域
随着分子生物学的理论及技术方法(特别是重组DNA技术)的迅速发展，人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因，使疾病深入至分子水平研究，于是诞生了基因诊断、基因治疗技术。
基因治疗从基因角度理解是对缺陷的基因进行修复增补，或将正常有功能的基因置换的方法。 从治疗角度理解是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。
当代基因治疗研究的热门方法是将外源基因DNA或RNA片段导入靶细胞或组织，研究靶基因的上调或抑制情况。例如，有些异常基因(癌基因、病毒基因)，可通过反义核酸技术引入外源片段将其抑制;有些基因本身有治疗作用，体外合成该基因导入体内使其表达丰度提高。
故选择合适高效的基因导入介质系统尤为关键。而病毒载体已成为当前基因治疗载体研究的热点，其优势在于:
1、病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产。
2、病毒基因组的结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备。
3、病毒的宿主范围广，且具有高效的靶向特异性。
4、在目的基因表达方面相对于脂质体介导的效果更明显、长时、稳定。
5、通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高。
慢病毒
慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
特点:
1、区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，常用于感染难转染的细胞，如原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、肿瘤细胞，且效率近100%
2、可装载DNA片段容量高达5kb
3、目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。
4、病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系。利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。
5、比较广泛采用的第三代包装系统--四质粒系统只含有HIV-1共9个基因中的3个，即gag、pol、rev。由于HIV-1基因组成分中60 %被去除,因此父代病毒无法复制，是重组系数最低的一个慢病毒包装系统，至今未见重组报道。其更安全、更稳定、更高效的技术优势领先于市场上的三质粒及其他包装系统。
综上特点决定了其应用、意义:
1、用慢病毒载体携带目的基因比用质粒瞬时转染更适于稳转株构建。
2、载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞的基因组中的序列元件，其产生滴度更高，为活体动物模型实验提供高性价比的包含目的基因的病毒液。
3、其高转导效率及整合到基因组的特点为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
作为快速有效的遗传物质投递工具，慢病毒在国内已广泛流行，更有众多包装服务公司兴起。同时，克服了对病毒的恐惧心理而选择自己包装的研究者也陆续增加。外包服务和DIY(Do It Yourself)相比，后者成本会大大降低。仅需买一个包装试剂盒、构建一个慢病毒载体即可进行实验。GeneCopoeia公司提供了一款基于第三代包装系统的包装试剂盒。试剂盒中包含除慢病毒基础载体和包装细胞外的其他所有成分:包装辅助质粒混合物，滴度增强剂，慢病毒专用转染试剂(EndoFectin Lenti)，eGFP阳性对照质粒。
慢病毒包装实验步骤与注意事项:
材料准备:包装试剂盒、病毒质粒、细胞;(注意事项:包装试剂盒的使用遵照说明书。检测病毒质粒浓度，确保DNA的OD(260nm/280nm)处于1.8-2.0之间，并电泳检测质粒是否完整。包装实验前准备好细胞，保证细胞状态良好。)
制备DNA/转染试剂复合物:此步骤比较简单，仅需按照试剂盒说明书操作。
转染工具细胞:通常使用293Ta细胞，将DNA-Endofectin Lenti复合物加入到装有包装细胞的培养板中。在37℃、CO2环境下过夜培养(8-14小时)，谨记培养6小时更换一次培养基，加入滴度增强剂TiterBoost，可增强滴度5-10倍。
收获病毒:收集转染48小时后的培养液，500 *g离心10分钟，去除细胞碎片杂质。接着用0.45 μm的聚醚砜蛋白结合过滤膜去除蛋白等杂质。收获纯度较高的病毒。
腺病毒
腺病毒(adenovirus )
腺病毒颗粒没有包膜的直径为70~90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7~9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35 000 bp，两端各有长约100 bp的反向重复序列。
腺病毒的结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳，病毒的基因组被包装进去，形成有感染能力的病毒颗粒，并最终裂解宿主细胞被释放出去，完成腺病毒的生活周期。
特点:
1、腺病毒具有宿主范围非常广，能感染增殖和非增殖各种细胞，如肝细胞、血管内皮细胞等
2、腺病毒基因组较大(36kb)绝大多数基因组均能被外源基因取代，故插入大片段外源基因的潜力大。
3、不整合到染色体中，目的基因在宿主细胞基因组外游历状态下表达，无插入致突变性，对人致病性低;
4、是瞬时转染，表达快速，容易将外源基因直接转移到靶细胞中，有效表达成活性蛋白。
5、能自行复制，有效进行增殖，产生滴度高;
6、与人类基因同源;
7、能在同一细胞株或组织中设计表达多个基因。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。
8、锐赛生物公司腺病毒载体通过对各元件的改造，进一步降低了集体的免疫反应和细胞毒性，提高了安全性，并提高了外源基因的靶向性表达。
综上腺病毒载体的特点，产生了其应用和意义:
1、应用于体内接种疫苗。用携带免疫调节基因或肿瘤特异抗原已近的腺病毒载体转入相应肿瘤细胞以诱导抗肿瘤免疫反应，可制成具有抗肿瘤活性的瘤苗。
2、应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究等科研实验。
3、可以完成较高难度的克隆构建，包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建，在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
4、产生滴度高，非常适于基因治疗。例如:Rosenfeld等用构建的含肌糖原磷酸化酶cDNA的重组腺病毒感染肝细胞，糖原磷酸化酶活性增加46倍，提示可以对糖原蓄积疾病进行基因治疗。
逆转录
逆转录病毒
一类含有逆转录酶的单链正链RNA病毒。慢病毒是逆转录病毒科中的亚科
原理:
逆转录病毒侵入宿主细胞后以自身RNA为模板，靠逆转录酶形成DNA环化后整合到宿主细胞的染色体中，以原病毒形式在宿主细胞中复制。
逆转录病毒的共同特性--
1、球形，有包膜，80~120 nm
2、基因组:单股RNA二聚体，核心有逆转录酶
3、复制通过DNA中间体，能与宿主细胞DNA整合
应用:
1)基因转染和稳定表达
2)具有在基因治疗和生物制药等领域的应用潜力[1]