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| 植物凝集素 |
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中文名:植物凝集素 發現時間:1888年 發現者:Stillmark 作 用:凝集紅細胞 |
植物凝集素是一類具有特異糖結合活性的蛋白，具有一個或多個可以與單糖或寡糖特異可逆結合的非催化結構域。凝集素最大的特點在於它們能識別糖蛋白和糖脂，特別是細胞膜中複雜結構的糖鏈，即細胞膜表面決定簇。 [1]
植物凝集素定義
植物凝集素最早發現於1888年，Stillmark在蓖麻(Ricinus communis L．)籽萃取物中發現了一種細胞凝集因子，它具有凝集紅細胞的作用。它是一類具有特異糖結合活性的蛋白，具有一個或多個可以與單糖或寡糖特異可逆結合的非催化結構域。根據植物凝集素亞基的結構特徵，植物凝集素分成4種類型：部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素、超凝集素；根據氨基酸序列的同源性及其在進化上的相互關係，植物凝集素分為7個家族：豆科凝集素、幾丁質結合凝集素、單子葉甘露糖結合凝集素、2型核糖體失活蛋白、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集素和莧科凝集素。
植物凝集素可識別並結合入侵者的糖結構域，從而干擾該入侵者對植物產生的可能影響；植物凝集素的糖結合活性是針對外源寡糖，參與植物的防禦反應。許多植物凝集素可結合到諸如Glc、Man或Gal的單糖上，尤其對植物中不常見外來的寡糖具有更高的親和性。例如：結合幾丁質植物凝集素識別真菌細胞壁及無脊椎動物的外骨骼成分中的碳水化合物。另外，許多凝集素在較高PH範圍內穩定、抗熱、抗動物及昆蟲蛋白酶等等。有些凝集素甚至是完全穩定的蛋白質，如從刺苟麻莖中分離出的凝集素在三氯乙酸中保持穩定，沸煮也不會失活。Peumans等(1998)認為大多數植物凝集素存在於儲藏器官中，它們既可能作為一種氮源，也可以在植物受到危害作為一種防禦蛋白發揮功能。因此植物凝集素是植物防禦系統重要的組成部分，在植物保護上起着重要作用。筆者就植物凝集素在植物保護上的研究進展作一綜述。
植物凝集素分類
豆科凝集素 豆科凝集素特指一類在豆科植物中發現的植物凝集素(並不是所有來自豆科植物的凝集素都是豆科凝集素)，已發現存在於70多種植物中，是研究得最清楚的凝集素家族。大多數豆科凝集素存在於植物的成熟種子中，但在葉、莖和根等組織器官中也有發現，並且，一些豆科植物還具有多種凝集素。
豆科凝集素均由2～4個亞基組成，大多數亞基為250個氨基酸殘基構成的分子量約為30 kDa的單鏈蛋白，部分亞基會在特定位點斷裂成2個多肽鏈，據此，又可將豆科凝集素分為單鏈豆科凝集素和雙鏈豆科凝集素。豆科凝集素是唯一一類具有特定二價金屬結合位點的凝集素，每個亞基都結合有一個Mn2+和一個Ca2+，它們對凝集素的糖結合活性發揮至關重要的作用，金屬離子並不直接與糖類相互作用，而是協助穩定糖結合結構域。並且，在所有豆科凝集素的亞基中，結合金屬離子的結構域的纈氨酸和天冬氨酸的量是十分保守的。
幾丁質結合凝集素 幾丁質結合凝集素含有至少一個橡膠素結構域，橡膠素是從巴西橡膠樹乳管細胞的黃色體中發現的分子量約為4.7 kDa的小分子酸性凝集素。 已在蕁麻科、禾本科、罌粟科、商陸科和茄科中發現幾丁質結合凝集素。根據含有的橡膠素結構域的個數，幾丁質結合凝集素又可分為只含有一個橡膠素結構域的部分凝集素及常見的含有多個橡膠素結構域的全凝集素，它們具有高度的序列同源性。
單子葉植物甘露糖結合凝集素 單子葉植物甘露糖結合凝集素是一個嚴格甘露糖結合特異性的凝集素超家族，已在蔥科、石蒜科、天南星科、鳳梨科、百合科和蘭科這六個單子葉植物家族中發現。構成此家族凝集素的亞基有相似的序列和三級結構，而凝集素本身的整體結構由於亞基的大小差距甚大。根據亞基大小，這一家族的凝集素可分成2個亞族：由含有一個結構域的分子量為11～14kDa的亞基組成的凝集素以及由具有2個結構域的分子量約為30 kDa的亞基組成的凝集素．第二個亞族又可根據亞基2個結構域的相似程度繼續細分為具有2個相同或高度相似結構域和2個不同結構域的凝集素。
木菠蘿相關凝集素 木菠蘿素是從木菠蘿種子中分離得到的一種凝集素，具有半乳糖結合特異性。木菠蘿相關凝集素家族是與木菠蘿素的結構和進化關係相近的一系列凝集素的統稱，這一家族的凝集素分為2個亞群：與木菠蘿素相似的具有GalNAc特異性的桑科種子凝集素。以及序列與桑科種子凝集素相似但糖結合特性相異的旋花科和菊科等凝集素，這一類凝集素具有甘露糖/麥芽糖結合特異性。
葫蘆科韌皮部凝集素 葫蘆科韌皮部凝集素髮現於葫蘆科植物的韌皮部，是由2個分子量約為25 kDa的非糖基化亞基組成的二聚體幾丁質結合凝集素，可識別GlcNAc寡聚糖，並且寡聚糖對凝集素活力的抑制程度隨糖鏈延長而增強。還未有此家族凝集素的完整序列被準確測定。
莧科凝集素 莧科凝集素家族較小，只存在於一些莧科植物中，發現不超過10種，均具有GalNAc結合特異性，並且在氨基酸序列及三維結構上與其他植物凝集素都存在差異。莧科凝集素都是由2個同源的亞基以頭一尾方式排列形成的二聚體。
植物凝集素功能特性
對植物病原菌的作用 植物凝集素作為微生物與植物的共生介質，可防止植物病原菌對植物的危害；Mishkid等(1982)研究發現，植物凝集素常積累於病原菌易侵染的部位，預示着凝集素可能參與對病原菌的防禦。
對植物病原真菌的作用 已有實驗證明，植物凝集素能結合真菌細胞、抑制孢子萌發和菌絲體生長。植物凝集素對真菌的抗生效應可能與它特異結合暴露於真菌細胞壁表面的糖複合物並導致真菌細胞壁及菌體結構形態改變有關，凝集素可與真菌表面的葡聚糖、半乳糖、甘露糖等多糖結合，干擾真菌細胞壁的合成，影響其細胞的正常代謝。Peumans和Van Damme(1995)進行的體外研究表明，麥胚凝集素(WGA)抑制綠色木霉的孢子萌發和菌絲生長，狹葉蕁麻凝集素抑制灰葡萄孢、鈎狀木霉和布拉克霉的生長。劉士莊等(1996)報道，棉花種子中凝集素含量與棉花抗枯萎病能力呈正相關，分離純化的棉花凝集素能明顯凝集枯萎病菌分生孢子，並抑制其萌發。曾日中等(1998)指出橡膠蛋白和其它植物凝集素一樣也具有抗真菌活性，可以抑制病原菌的侵染和生長，起到保護橡膠樹乳管的作用。余萍等(2004)研究發現狗脊蕨凝集素(w兒)對玉米大斑病菌有抑制作用。
對植物病原細菌的作用 由於細菌細胞壁的作用，凝集素不能進入細菌細胞質，因此不能改變細胞膜結構或滲透細胞膜擾亂侵人微生物的正常細胞間進程。植物凝集素是通過一種基於與細胞壁糖類，或細胞外聚糖相互作用的機制對細菌構成抗生效應。Sequeira(1977)等報道馬鈴薯凝集素能抗青枯假單胞菌；Broekaet (1986)等提出，刺蘋果種子凝集素可使幼根免受細菌侵染。Ayouba等(1994)研究指出，幾種豆科植物種子凝集素可與細菌細胞壁肽聚體(胞壁酸、N一乙酰胞壁酸、胞壁酰二肽等)發生強烈的相互作用。余萍等(2004)研究發現狗脊蕨凝集素 (wJL)對甘薯薯瘟病原細菌生長具有抑制作用。
對植物病毒的作用 植物病毒不含聚糖，沒有凝集素的作用位點，因此植物凝集素對植物病毒無抑制作用。Peumans和Van Damme(1995)綜述道，一種稱為核糖體失活蛋白型的特殊類型凝集素對植物病毒具有抑制活性，其機理尚不清楚。但有殺蟲活性的凝集素可能會阻止或減少蟲傳播病毒病害的傳播。 對植物病原線蟲的作用 這方面研究相對較少，僅常團結等(2002)報道純化的雪花蓮外源凝集素(GNA)可以抗植物病原性線蟲。
對昆蟲的作用 植物凝集素對昆蟲如同翅目昆蟲及動物產生毒害的機理還不清楚，一般認為植物凝集素可能通過和糖蛋白，如和昆蟲圍食膜表面、消化道上皮細胞的糖綴合物、或糖基化的消化酶等結合，從而影響昆蟲、動物對營養吸收，促進消化道中細菌的繁殖和誘發病灶，抑制昆蟲的生長發育和繁殖，最終達到殺蟲、或對動物產生毒害的作用。
菜豆凝集素(PHA)是第一個被描述的具有抗蟲性的植物凝集素。有趣的是，PHA對豆象幼蟲具有毒性的結論是基於一個錯誤的實驗結果，後來研究發現這種防衛作用是由於含有A一澱粉酶抑制劑的緣故(Huesing等1991 。如今許多實驗表明，來源於麥胚、馬鈴薯塊莖、核桃、沙棘、水稻和刺蕁麻的凝集素對豌豆象甲幼蟲和豇豆象甲幼蟲的生長有抑制作用。WGA和紫色羊蹄甲種子凝集素在濃度很低時對歐洲玉米螟新生幼蟲就有致死作用；從雪花蓮和大蒜提取的凝集素對豇豆象鼻蟲和煙草天蛾幼蟲有毒性。雪花蓮凝集素(GNA)等對咀嚼式昆蟲和刺吸式昆蟲都有致死作用。黃大叻等 (1997)報道來源於掌葉半夏和半夏的凝集素對麥長管蚜、禾縊管蚜、棉蚜和桃蚜等有致死活性。王偉等(1998)獲得同時表達P—lec(豌豆外源凝集素基因)和CpT1(豇豆胰蛋白酶抑制劑)的雙價轉基因棉花，棉鈴蟲的存活率、平均體重、生物總量及蛻皮指數均明顯低於對照。毛雪等(1999)利用全純營養液飼養蚜蟲技術明確鑑定了棉花凝集素 (GHA)、蓖麻凝集素(ACA)、天南星凝集素(AMA)和伴刀豆凝集素(ConA)對棉蚜和麥長管蚜的抗生作用，儘管所測凝集素半致死濃度有差異。對於長角葉甲，Czapla實驗表明WGA、BPA可抑制40%的蟲重，來源(EHL)凝集素在2%水平上致死率為100%，但由於EHL的熱不穩定性，後來的實驗結果有些不一致；在0．1%水平上雪花蓮凝集素(GNA)、WGA對1齡、3齡灰、褐飛虱作用都非常明顯，同對照相比死亡率大於75%；WGA對黑尾葉蟬的致死率為l5%，GNA的致死率為87%；Powell等人以GNA、WGA 0．1%(w/v)人工飼料飼餵灰、褐飛虱，24h內降低蜜汁分泌96%，而且GNA的抗性效果最佳；但豌豆凝集素對黑尾葉蟬成蟲則沒有效果；此外WGA、豌豆凝集素等5種凝集素也能減少馬鈴薯葉蟬成活時間。最近的工作發現刺吸式口器昆蟲如椰粉虱、葉蟬、蚜蟲等對一些單子葉植物甘露糖結凝集素敏感。劉紅霞等(2004)研究發現刺槐種子凝集素對舞毒蛾幼蟲的營養代謝有較強的抑制作用。 對高等動物捕食者的作用。
同昆蟲一樣，高等動物消化道上布滿了細胞膜糖蛋白及高度糖基化的粘蛋白，這就成了植物凝集素的無數作用位點，保護植物免受食草動物侵食。如動物食用植物血細胞凝集素(PHA)或生豆後會引起急性噁心伴有嘔吐和腹瀉，以至於動物寧肯挨餓也不食用含PHA飼料。
植物凝集素應用及前景
在生物學研究方面的應用 植物凝集索由於專一的識別某一特定單糖或多糖中的特定糖基序列，不僅用於分離純化，也用於糖鏈的結構分析。它們可識別糖鏈的不同類型、不同核心結構，探測糖鏈分布，選用多種凝集索反覆核對糖鏈的結構可獲得較為準確的結論。利用凝集素親和層析。親和電泳和抗體凝集素酶免疫測定凝集素和糖鏈結合的強弱。細胞表面的糖鏈結構因細胞種類、分化階段或功能狀態而異，因此可以利用凝集素分離無損傷，高存活率，高產量的特定結構細胞亞群。在免疫學上植物凝集索還是不可缺少的促淋巴細胞有絲分裂劑。在神經學科上，研究神經元表面結構，外周神經元損傷帶來的後果及其修復機制，細胞神經遞質受體等。
醫藥方面的應用 在某些惡性腫瘤中，某些蛋白如原發性肝癌中N一糖鏈發生變化，以此作為腫瘤診斷和鑑定。某些植物凝集素具有毒性，研究人員將完整的毒素分子或α鏈作為彈頭，利用化學偶聯劑與單克隆抗體製備成免疫毒素。免疫毒素可用於骨髓移植，體外清除其中的T細胞進行異體移植，清除其中的癌細胞進行自體移植，並防止減輕移植物抗宿主病。因此，在基因水平對小分子抗體和高活性的毒素彈頭相偶聯，將為腫瘤的導向治療提供新途徑。除抗體外，一些細胞因子和特定的糖鏈也可以作為導航裝置，也有將人絨毛促性腺β亞基和RTA相偶聯的報道。
在農業抗蟲方面的應用 已經克隆了一些對害蟲抗性較好的基因，並取得一些進展。在植物中表達凝集素要求相對高的水平才具有較好的抗蟲效果，構建強的高效表達載體，採用合適的強啟動子，針對害蟲取食是韌皮部都可採用特異性表達啟動子，或與其它的殺蟲蛋白相結合提高抗性。但植物凝集素對刺吸式害蟲的殺蟲性還不盡人意，有必要深入研究其作用機理，制定相應策略提高抗蟲效果，着手新的抗蟲植物凝集素的克隆。與此同時，轉基因作物的安全有待進一步證實。
糖工程是繼70年代基因工程，80年代蛋白質工程之後的第三個前沿領域，植物凝集素在糖生物學研究中作為信息識別分子倍受矚目。隨着凝集素數據庫的建立，糖鏈結構分析，糖鏈合成方法學，X-ray單晶衍射的發展，將有更多的凝集素的三維立體結構，糖識別機製得以闡明。凝集素對糖識別機制的研究必將推動分子生物學、細胞生物學、病理學、免疫學、神經生物學、發育生物學等學科的發展。
植物凝集素結語
隨着人們長期單一地在作物中導人某個基因，如Bt基因，又出現了新的問題。一是應用這類基因不能有效防治有些害蟲，如引起同翅目蚜蟲在轉Bt棉上的再猖獗現象；二是某些害蟲已對這類長期使用的基因產生了抗性，如鱗翅目的棉鈴蟲和小菜蛾已對Bt基因產生了不同程度的抗性。
這種情況下，植物凝集素以其具有對鱗翅目、特別是對同翅目蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲及一些微生物有防效，對環境無污染，穩定性好及對高等動物相對安全等優點，為防治病蟲害開拓新思路。不可否認，植物凝集素作為植物基因工程的一部分，將在培育抗病蟲品種、發展可持續農業中大顯身手，植物凝集素更多的應用於轉基因抗蟲品種的培育，抗病品種篩選上還有待於突破。
另一方面，植物凝集素對刺吸式害蟲的殺蟲性還不盡人意，如抗蟲性不強、抗蟲譜不廣等，因此有必要深入研究其作用機理，制定相應策略提高抗蟲效果。 外源凝集素基因是一組廣泛存在於植物組織中的蛋白質成分，在儲藏器官和繁殖器官中的含量尤其豐富。外源凝集素對植物有許多很重要的生理作用，其中在作物害蟲防治方面所能表現出的作用是保護功能，即在植物生長的各個階段，外源凝集素以不同的方式保護植物免受害蟲的侵害。研究結果表明，外源凝集素主要存在於植物細胞的蛋白粒中，一旦被害蟲攝食，外源凝集素便會在昆蟲的消化道內釋放出來，並與腸道圍食膜上的糖蛋白相結合，影響營養物質的正常吸收。
同時，還可能在昆蟲的消化道內誘發病灶，促進消化道內細菌的增殖，對害蟲本身造成為害，從而達到殺蟲的目的。因而引起了人們對探討外源凝集素基因在抗蟲植物基因工程中應用的極大興趣。人們已分離出多種外源凝集素基因，然而由於多種外源凝集素對人和哺乳動物有較強的毒副作用，因而在生產上應用較少。但也有一些特例，其中豌豆外源凝集素和雪蓮花外源凝素（GNA）對人的毒性極低，但對害蟲卻有極強的抑制作用，因而倍受人們的重視。
現已證明GNA對稻褐飛虱、黑尾葉蟬有極強的毒殺作用，同時還能抑制蚜蟲的生長。因而通過植物基因工程技術將GNA基因導入到植物體內，以培育出對稻褐飛虱、蚜蟲等刺吸式害蟲有抗性的轉基因植物。已有至少10種植物獲得了轉GNA基因抗蟲植株，它們分別是油菜、西紅柿、水稻、甘蔗、甘薯、向日葵、煙草、馬鈴薯、大豆和葡萄等，均表現出一定的抗蟲性。