導覽
近期變更
隨機頁面
新手上路
新頁面
優質條目評選
繁體
不转换
简体
繁體
3.149.234.188
登入
工具
閱讀
檢視原始碼
特殊頁面
頁面資訊
求真百科歡迎當事人提供第一手真實資料,洗刷冤屈,終結網路霸凌。
檢視 逆转录PCR 的原始碼
←
逆转录PCR
前往:
導覽
、
搜尋
由於下列原因,您沒有權限進行 編輯此頁面 的動作:
您請求的操作只有這個群組的使用者能使用:
用戶
您可以檢視並複製此頁面的原始碼。
{{Reflist}} {| class="wikitable" align="right" |- | style="background: #008080" align= center| '''<big>逆转录PCR </big> ''' |- | [[File:T01934822efbd4e6be7.png |缩略图|居中|[https://img.wendangxiazai.com/pic/d4be143201f69e31433294f8/2-474-png_6_0_0_0_0_0_0_892.979_1262.879-675-0-0-675.jpg 原图链接][https://image.so.com/view?q=rt-pcr&src=tab_baike&correct=rt-pcr&ancestor=list&cmsid=60ae14a9f1de1a52d5c5acc0176e04dd&cmras=6&cn=0&gn=0&kn=0&crn=0&bxn=0&fsn=60&cuben=0&pornn=0&manun=0&adstar=0&clw=282#id=7bf798aebe1da1d216d6ac301afd2300&currsn=0&ps=59&pc=59 来自 360 的图片]]] |- | style="background: #008080" align= center| |- | align= light| |} RT -PCR即逆转录-聚[[合酶链]]反应。原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的[[灵敏]]性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 =='''基本信息'''== 中文名; 逆转录-聚合酶链反应 外文名; RT -PCR 主要用于; 构建RNA高效转录系统 =='''简介'''== RT- PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)即逆转录PCR,是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为[[模板]],扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。 用于反转录的引物可视实验的具体情况[[选择]]随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。 =='''反转录酶的选择'''== 1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的[[聚合酶活性]],RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。 4.MMLV反转录酶的RNase H突变体:商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 折叠编辑本段合成cDNA引物的选择 1. 随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2. Oligo(dT):是一种对mRNA特异的[[方法]]。因绝大多数真核[[细胞]]mRNA具有3'端Poly(A)尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA 3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。 =='''试剂准备'''== 1.RNA提取试剂 2.第一链cDNA合成试剂盒 3.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4.Taq DNA聚合酶 =='''操作步骤'''== 1. 总RNA的提取:见相关内容。 2. cDNA第一链的合成:目前试剂公司有[[多种]]cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以长沙赢润生物技术有限公司提供的操作手册为例: (1)在0.5ml微量离心管中,加入总RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心。 (2)70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物: 10×PCR buffer 2μl 25mM MgCl2 2μl 10mM dNTPmix 1μl 0.1M DTT 2μl 轻轻混匀,离心。42℃[[孵育]]2-5min。 (3)加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。 (4)于70℃加热15min以终止反应。 (5)将管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。 3.PCR: (1)取0.5ml PCR管,依次加入下列试剂: 第一链cDNA 2μl 上游引物(10pM) 2μl 下游引物(10pM) 2μl dNTP(2mM) 4μl 10×PCR buffer 5μl Taq 酶(2u/μl) 1μl (2) 加入适量的ddH2O,使总体积达50μl。轻轻混匀,离心。 (3) 设定PCR程序。在适当的[[温度]]参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照。 (4) 电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。 (5) 密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。 =='''注意事项'''== 1. 在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。 2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。 3. 内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的[[温度]]差等所造成的误差。 4. PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。 5. 防止DNA的污染: (1) 采用DNA酶处理RNA样品。 (2) 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。<ref>[https://baijiahao.baidu.com/s?id=1678522332372908872 逆转录 PCR详解], 百度讯 , 20-09-22</ref> =='''参考文献'''== {{reflist}} [[Category:360 生物科學總論]]
此頁面使用了以下模板:
Template:Main other
(
檢視原始碼
)
Template:Reflist
(
檢視原始碼
)
模块:Check for unknown parameters
(
檢視原始碼
)
返回「
逆转录PCR
」頁面