檢視反向PCR 的原始碼

{| class="https://image.baidu.com/search/detail?ct=503316480&z=0&ipn=d&word=%E5%8F%8D%E5%90%91PCR&step_word=&hs=0&pn=0&spn=0&di=7077213605308923905&pi=0&rn=1&tn=baiduimagedetail&is=0%2C0&istype=0&ie=utf-8&oe=utf-8&in=&cl=2&lm=-1&st=undefined&cs=2268812133%2C3292022308&os=1606484317%2C2196442073&simid=3368656954%2C178641720&adpicid=0&lpn=0&ln=548&fr=&fmq=1651380164761_R&fm=&ic=undefined&s=undefined&hd=undefined&latest=undefined&copyright=undefined&se=&sme=&tab=0&width=undefined&height=undefined&face=undefined&ist=&jit=&cg=&bdtype=0&oriquery=&objurl=https%3A%2F%2Fgimg2.baidu.com%2Fimage_search%2Fsrc%3Dhttp%3A%2F%2Fa4.att.hudong.com%2F32%2F86%2F20300001291914131666865698303_s.jpg%26refer%3Dhttp%3A%2F%2Fa4.att.hudong.com%26app%3D2002%26size%3Df9999%2C10000%26q%3Da80%26n%3D0%26g%3D0n%26fmt%3Dauto%3Fsec%3D1653972211%26t%3D43d22ac0b2b37eae6872dde217c236e6&fromurl=ippr_z2C%24qAzdH3FAzdH3Fooo_z%26e3Bkwthj_z%26e3Bv54AzdH3FothtAzdH3F%25Ec%25bF%25bD%25Ec%25la%25l8PCR%26r61%3Dp7rtwgvhxx&gsm=1&rpstart=0&rpnum=0&islist=&querylist=&nojc=undefined" style="float:right; margin: -10px 0px 10px 20px; text-align:left"
|<center>'''反向PCR'''<br><img
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PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列。 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对[[引物]]之间而是在引物外侧合成DNA。

*中文名:[[反向PCR]]

*外文名:Reverse PCR

*适用领域:基因研究

*所属学科:[[生物学]]

==原理==
反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或[[染色体步移]]。这时选择的引物虽然与[[核心DNA]]区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用[[限制性内切酶酶切]]样品DNA，然后用[[DNA连接酶]]连接成一个[[环状DNA]]分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了[[酵母人工染色体]]（YAC）大的线状DNA片段的[[杂交探针]]，这对于[[转座子插入序列]]的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

==不足之处==
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行[[酶切]]才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非[[酶切位点]]切断靶DNA。②大多数有核[[基因组]]含有大量中度和[[高度重复序列]]，而在[[YAC]]或[[Cosmid]]中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

==其他用途==
利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长[[cDNA]]进行[[分子克隆]]，建立全长的[[DNA探针]]。适用于基因游走、[[转位因子]]和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

用传统的[[缓冲液]]和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 [[PCR扩增]]片段的大小决定，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先 需要进行[[Southern杂交]]来确定[[内切酶]]用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个[[碱基]]位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入 合适的[[酶切位点]]。<ref>[[ 张晓，张锐，孙国清，史计等.    优化的反向PCR结合TAIL-PCR法克隆棉花线粒体atpA双拷贝基因及其侧翼序列． 《 生物工程学报 》 ， 2012]]</ref> 

用T4[[连接酶]]在稀DNA浓度下[[环化]]更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种[[内切酶]]，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或[[噬菌体T4DNA聚合酶]]修理([[钝化]])。连接前，需用酚或[[热变性]]使内切酶失活。

[[聚合酶链反应]]条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火，[[ Taq聚合酶]]70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。

'''视频'''

'''PCR 衍生技术'''

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==参考文献==
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[[Category:360 生物科學總論]]