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民国十六年(1927年)8月1日，周士第率部参加 [[ 南昌 ]] 起义，任第25师师长。起义军南下广东失利后，辗转 [[ 香港 ]] 、 [[ 南京 ]] 、 [[ 上海 ]] 、 [[ 西安 ]] 、 [[ 福建 ]] 等地，曾参加邓演达领导的中国国民党临时行动委员会和 [[ 黄埔 ]] 革命同学会，参与策划推翻 [[ 蒋介石 ]] 。

民国二十年(1931年)夏，周士第被捕，后在 [[ 宋庆龄 ]] 的营救下获释。

民国二十一年(1932年)1月， [[ 上海 ]] 淞沪抗战爆发后，周士第曾任上海抗日义勇军队长。

民国二十二年(1933年)，福建事变后，周士第到 [[ 蔡廷锴 ]] 的第19路军参加反蒋活动，任第49师参谋处长、团长。同年底到中央苏区首府江西瑞金，任红军大学军事教员。