用限制性核酸內切酶處理克隆載體，以在將要插入外源DNA的位點切割DNA。選擇限制酶以在切割位點產生與外源DNA的末端相容的構型。通常，這通過用相同的限制酶例如EcoRI切割載體DNA和外源DNA來完成。 大多數現代載體都包含各種方便的切割位點，這些位點在載體分子內是唯一的（因此，該載體只能在單個位點上被切割），並且位於一個基因（通常是 [[ β-半[[ 乳糖苷酶]] ）中，其失活可以用來區分從非重組生物體中重組而來。 為了提高重組生物與非重組生物的比例，可以使用使載體末端去磷酸化的酶（ 鹼性磷酸酶 ）處理裂解的載體。 具有去磷酸化末端的載體分子無法複製，並且只有在將外源DNA整合到切割位點的情況下才能恢復複製。