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Northern印跡雜交(Northern blot)。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern於1975年創建,稱為Southern印跡技術,RNA印跡技術正好與DNA相對應,故被稱為Northern印跡雜交,與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Western blot。

RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法

<1>試劑 10×MSE緩衝液:0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸鈉,1mmol/LEDTApH8.0。

5×載樣緩衝液:50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4%溴酚藍。

甲醛:用水配成37%濃度(12.3mol/L),應在通風櫃中操作,pH高於4.0。

20×SSC;

去離子甲酰胺;

50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl);

0.1mol/LTris,pH7.5。

<2>步驟 [1]40ml水中加7g瓊脂糖,煮沸溶解,冷卻到60℃,加7 ml 10×MSE緩衝液,11.5ml甲醛,加水定容至70ml,混勻後倒入盛膠槽。

[2]等膠凝固後,去掉梳子和膠布,將盛膠槽放入1×MSE緩衝液的電泳槽。

[3]使RNA變性(最多20μg),RNA4.5ml,10×MSE緩衝液20ml,甲醛3.5ml,去離子甲酰胺10ml。

[4]55℃加熱15min,冰浴冷卻。

[5]加2 ml 5×載樣緩衝液。

[6]上樣、同時加RNA標記物(同位素(32P)dCTP)。

[7]60伏電泳過夜。

[8]取出凝膠,水中浸泡2次,每次5min。

[9]室溫下將膠浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min,水解高分子RNA,以增強轉印。

[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

[11]20×SSC洗膠1h。

[12]20×SSC中過夜轉印到硝酸纖維素膜上。

[13]取出硝酸纖維素膜,80℃真空烘烤2h。

<3>注意事項

[1]嚴格遵守試驗規則,務必準確。

[2]由於好多藥品是有毒的,對人體有害,請注意自身安全,做好防護。[1]

簡介

Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似,只是在上樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性,而不用NaOH,因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性後有利於在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合,它同樣可在高鹽中進行轉印,但在烘烤前與膜結合得並不牢固,所以在轉印後用低鹽緩衝液洗脫,否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB,因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結合。為測定片段大小,可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳,之後將標記物切下、上色、照相,樣品膠則進行Northern轉印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min,光在水中就可脫色,在紫外光下用一次成像相機拍照時,上色的RNA膠要儘可能少接觸紫外光,若接觸太多或在白熾燈下暴露過久,會使RNA信號降低。

瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時,甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑,但是有毒,因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免RNase的污染。

原理:

整合到植物染色體上的外源基因如果能正常表達,則轉化植株細胞內有其轉錄產物——特異mRNA的生成。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離,則不同的RNA分子將按分子質量大小依次排布在凝膠上;將他們原位轉移到固定膜上;在適宜的離子強度及溫度條件下,用探針與膜雜交;然後通過探針的標記性質檢測出雜交體。若經雜交,樣品無雜交帶出現,表明外源基因已經整合到植物細胞染色體上,但在該取材部位及生理狀態下該基因並未有效表達。[2]

參考文獻