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| 空间细胞培养 | |
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空间细胞培养，用于研究具有制药前景的动物细胞、植物细胞的空间培养。研究空间细胞培养方法和微重力条件对细胞生长、代谢、合成及分泌物活性的影响。在神舟3号上使用我国自行研制的细胞反应器进行了"人体组织淋巴瘤细胞"、"人大颗粒淋巴细胞"、"抗衣原体蛋白小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞"、"抗天花粉蛋白小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞"的培养。
研究意义
征服太空，开发利用太空资源是人类长期以来的梦想。随着科学技术的进步，今天人类的这一梦想正在逐渐地变为现实。目前，人类对短期进入微重力环境适应过程中的有关生物学机制有些初步了解，长期(数年)在空间生活的影响还有待进一步认识。细胞是构成生命有机体的基本结构和功能的单位，不管在失重条件下人体在生理等方面表现如何，微重力环境下产生的所有效应均是单细胞本身或细胞间相互产生反应的最高形式。著名的细胞生物学家B.Wilson早在1925年就指出，生命科学问题的答案必定从细胞中去寻找。开展空问细胞科学研究是人类认识及征服太空的必由之路。但是细胞的生长需要一定的条件，包括温度、湿度、氧气、养料、pH等，它们有复杂的代谢需要，并且对器皿壁的相互作用和流体应力十分敏感，尤其对纤弱的哺乳动物细胞更是如此，因而空间细胞培养的研究是开展空间细胞生物学研究的基础与前提条件。[1]
近年来，生物医学界报道了许多成功的临床应用例子，如单克隆抗体、基因工程重组蛋白、细胞因子、疫苗等，这些生物技术产品都有很高的经济和社会效益，往往涉及动、植物细胞的大规模培养技术。微重力环境为细胞培养提供许多有利之处，由于空间无沉降无对流的特性，物质可以均匀悬浮，细胞不会因重力场的影响而沉降堆积在一个表面，这对于进行细胞的高密度培养，提高介质的利用率和单位容积的产量，减少其它蛋白的污染都是有利的;并且空间纯净的培养环境，获得更加均一、更加纯净的物质的潜力，防止污染等，为空问制药带来了许多有利之处;特别是近些年来报道空间细胞的生物合成和分泌作用发生改变，某些重要蛋白质的产量和品质可以提高;在微重力下细胞具有三维生长的潜能。因而空间细胞培养是目前国际看好的三大空间生物技术(蛋白质结晶，细胞培养，生物分离)之一，也是空间生物加工的重要组成部分。[2]
研究概况
培养装置
国外在空间细胞培养方面所用的装置在70年代初期一般都是由小的培养容器组成，仅允许进行一次性批量试验，比较简单，无传感器和在线监测。这些放在培养箱内的小容器80年代陆续在空间作了试验。
80年代研制的培养箱和细胞培养小室能用电池或飞船动力系统来维持37℃(+/-1℃)恒温，在培养箱里的培养小室采用活塞密封，活塞能够移动来调整室内的体积，实验用药品如激活剂、固定剂的加入需要通过一个厚的硅橡胶膜。在航天飞机STS-8，STS-9和STS-40上飞行过的培养箱曾包含4个12ml的培养小室和8个注射器。
所有早期的空间细胞生物学实验可称为批量培养实验，培养时间很有限，因为细胞被培养在一个固定容量的培养基中，随着时间的延长，营养物质会耗竭，代谢产生的废物会蓄积。于是动态细胞培养系统应运而生。80年代后期瑞士/德国利用渗透泵原理研制了一种新的动态细胞培养系统(DCCS)。它是一个封闭的系统，该系统设有气室和2个培养小室，一个为批量培养，一个为灌注式培养。培养室容积为200ul，新鲜培养基储备库的容量达230ul。自驱动的渗透泵可以1ul/h的流速将新鲜培养基供应给细胞。DCCS适合于放人欧空局(ESA)的生物柜的1型容器(81×40×20 mm)内。该装置是由ESA的PRODEX计划资助完成的。第一次用DCCS进行的实验是1989年在前苏联飞行14天的生物卫星Biokosmos 9上进行，研究了植物原生质体的生长和发育。第二次是在1992年国际微重力实验室IML-1的飞行任务中，研究了微重力对仓鼠肾细胞的影响。与成批培养方式相比，DCCS的细胞生长得更好，产生更多的组织纤溶酶原激活物。
为了对高效益的产品如药物，以及对支持人类生存的受控生态生命支持系统补充食物供应及废物再循环进行有效的空间生物加工，生物反应器的设计与制作被提到了日程上。生物反应器(bioreactor)系统包括中空纤维式、薄膜式和灌注式等。80年代下半期美国Johnson空间中心研制了有相当精度可监测控制的系统。细胞在有缓慢搅拌的(15rpm)旋转式的带过滤的灌注系统内培养，工作容积250ml。过滤系统可以存留住细胞和微载体，气体交换通过一中空纤维式的充氧器来完成。整个装置放在有湿度控制的c02培养箱内，有通道监测和标准培养参数的控制，如湿度、pH、底物、产物浓度等。90年代用于酵母细胞培养的小型化生物反应器装备有加样、pH值控制、气体交换、连续的新鲜培养基供应和在线检测能力。发展这样硬件设备所受到的真正挑战来自要求商品化生物反应器集成几乎所有功能，这需要把它的体积由原来的l升降至365ml(87×63×6mm)，以适应生物柜的II/E型容器。连续培养酵母细胞的新型微型生物反应器被发展了起来，体积87×63×63 mm，重量610 g。100ml的新鲜培养基能通过微量泵以不同的速率输送入3ml的培养小室。培养物用磁力搅拌子搅拌;pH值、温度和还原电势的变化通过微传感器监视;有一个窗口允许观测培养状态;数据被发往地面分析。这个装置被ESA选用于1994年7月的IML-2飞行任务。生物反应器所涉及的传感器、pH控制、营养泵和液流计均基于硅半导体技术。经过两轮的成功飞行测试，新一代的装置正准备用于2000年的飞行试验。
培养方法
在地面，用常规方式培养的细胞的生长受到重力的作用，引起细胞聚集物的沉淀。另外，目前实验室和生化工程所用的机械悬浮法(如摇床、机械搅拌、气升法等)使细胞受到剪切力的作用，既容易损伤组织细胞，也影响细胞聚集物的形成。而在微重力环境下，细胞聚集物能向着三维方向生长，从而给了科学家一个模拟体内情况研究细胞间相互作用和组织发育的良好模型。通过细胞单培养(mono-culture)和共培养(co-culture)可以发现有价值的细胞接触方式和作用细节。细胞培养器曾运送到和平号空间站并整合在其生物技术系统(ms)内。培养时间则由光镜和照相监视输出来决定，样品可固定或低温保存以便回地面分析。这是NASA Johnson空间中心开始研究的，并已初步取得了很好的结果。
在生物材料加工方面，已分离出地面很难分离的哺乳动物特化细胞和蛋白质，其纯度比地面所分离的高4~5倍，分离速度提高柏0~700倍，这些都给药物学研究带来了新的生机。全球最大的制药公司已与美国宇航局合作，试图在太空生产出治疗癌症、糖尿病、肺气肿及免疫系统失调的药物。预计到21世纪20年代，在"阿尔法"空间站计划建造的六个实验室里开展的一系列工作，将为生物、医药、工业的进步和人类生活条件的改善开辟捷径。
国外关于空间细胞培养装置的发展趋势是针对空间生物技术的商业化问题，进一步研究细胞对微重力条件的反应;改进设计在微重力下的培养装置;改进通道监测，发展灵敏的生物传感器，使能精确有选择性的监测介质中的各类分子;改进高性能的化学上限定的培养介质，达到更高密度和高产的培养等等。
培养条件
80年代后期国外在空问细胞飞行装置内普遍地装上了1g参照离心机，从而可以在同样的条件下进行对比试验，使微重力在细胞水平的影响可以得到比较规范的研究和确认。
细胞培养时，贴壁依赖性细胞的一个基本特征是具有贴附到物体表面以便生长的能力和需要。细胞通过分泌一些细胞外基质使自身与固体支持物进行接触并固着。在地球上，通常细胞在沉降到培养瓶底面和微载体上时，通过接触粘附到固相表面上。STS-8航天飞行试验中证实，在空间细胞膜和黏附蛋白的分泌是正常的，人肾细胞在微重力环境中甚至比地面对照更有效地贴附在微珠上，因此将细胞运往空间，用冷冻和其他方法进行固定化，在需要的时候进行培养是可行的。这对于未来的长期空间探索和在空间站进行生物学基础研究，以及生物技术的商业开发都是极为重要的。
微囊化是固定细胞的一种方法，它是一个由半透性多聚物层包围的藻酸盐所形成的复合微滴。这种多聚物是多孔的，可使液体自由进出，但也保护了细胞，可减少在生物反应器中由于发射和返地时重力急剧变化等因素引起的剪切力的损伤作用。
在哺乳动物细胞保存研究方面，有报道用subcooling-in-oil技术保存有生物活性的细胞，以便于今后在国际空间站的研究。用于宇航试验的干燥血细胞保存方法，避免了使用冰箱等冷冻设备。标准的收集宇航员血样的方法是在真空管中的胶分离法(滤过液体成分，保留细胞成分)。在微重力条件下于燥收集和保存可更好地保存样品的化学特性，如80%的常用分析物可不用电解质保存数月。
空间细胞的培养应是无菌的，细胞应在即将发射之前放人飞船。各种细胞是有可能在轨道内培养30天左右的。培养类型可以适用于悬浮、贴附的动植物细胞，动物组织，细菌和微小的非饲养类的微生物。新鲜细胞可来自输送到ISS的冻存细胞。3、10或30ml培养体系需维持在4~40°C和适当的湿度、pH下、二氧化碳、氧气浓度均严格控制在一个大气压下。用相差/荧光显微镜可观察到细胞的图象，如果需要，图象数据能被发回地面实验室。作为参照，可以在空间站做人工重力环境下(0.1~2.0 g)的对照实验。营养物或特殊添加剂(如为方便在地面进一步研究所需的终止实验样本的固定剂)被自动加入，代谢废物也能自动被去除。标本或培养基质可在轨道直接进行及时的操作或冻存。一些基本的操作，如溶液混合、核酸抽提、胰酶消化、过滤、浓缩，可用半自动化的方法，或由宇航员协助。
地面模拟
由于空问飞行研究的费用昂贵，进人空间的机会难得，并受到运载能力等的限制，同时也为确保难得和昂贵的空间试验的成功，十分需要首先在地面进行大量的预试验，以提高空间试验的安全性和可靠性。国外的经验表明，一次成功的飞行试验往往需要事先经过约2年左右时间的地面研究积累。这也要求我们设计制造各种模拟微重力效应的装置来进行空间细胞培养的地面研究。目前主要的地面模拟装置有回转器(clinostat)、随机定位机(random positioning machine，or tridimensional clinostat)、转壁容器(rotating wall vessel)、细胞培养舱(cell culture module，CCM)、自由落体机(free fall machine)等。
当前细胞科学面临的挑战是，绝大多数细胞培养产生的是单细胞层的标本，而我们迫切需要了解的是细胞之间怎样相互联系协同工作。空间试验表明，细胞在微重力下具有类似于在活体内的三维生长的潜能。NASA的Johnson空间中心研制的生物反应器系统是解决这一问题的有效尝试。作为研究微重力效应对于细胞影响的模型，它的核心是一个转壁容器，包括慢转横管(slow turing lateral vessel)和高位转管(high aspeet rotating vessel)，通过旋转含有培养细胞的液体培养基来中和重力效应，在一个较大剪切力范围内(0.2~0.92 dyn/cm)进行模拟研究，使细胞能以近似自然的方式生长。肠癌、小肠和软骨细胞的地面培养研究已获得极大成功。在长时问的空间任务中，大样品生长能被用来研究细胞的扩张生长和分化，如工程化的复杂组织和慢生长肿瘤的模型。
细胞培养舱(CCM)是为飞行和地面对照实验而设计的生物反应器系统，其基本结构是利用中空纤维来输送和交换养分和废物。氧气输送和二氧化碳缓冲系统掺人到培养基循环中。CCM还包括保存试剂和样品的冷冻室。CCM设计有三个区，每个区可以放置四个大的或六个小的生物反应器盒。生物反应器根据其大小可以容纳106孔或几个小结节愈伤组织或组织纤维。纤维孔径从4000 Dalton到0.5微米可选。研究者可选择单一供应物的再循环或小容量定时更换。通过自动添加反应试剂，定时取样，许多实验参数和应答可被研究。在微重力下可完成特定刺激与微重力相互作用的时间分析图示。但是由于其物理条件(尺度、重量和电源)的制约，操作是有限的，而实验往往需要对一个样品重复几次操作或需要同时对一个样品进行两种操作。总之，简单的直截了当的试验成功的机会要大得多。
随机定位机器由日本的T.Hoson发明，Fokker Space，NL制造，可以通过两个框架的随机旋转模拟微重力环境，承载重量能达到20 kg。
自落机由ESA的D.Mesland发明，CCM，NL制造，持续800ms的微重力条件可通过重复性的1~2 m自由落体运动接着以持续40ms的15g反弹产生出来。
空间细胞培养地面模拟的重要性及其在理论与实践上的意义正受到日益重视，国外这方面的研究进展很快，特别在美国和德国。地面模拟研究的成果已经应用于临床实践。我国目前尚处于起步阶段，有少数几个单位已开展了这方面的研究，国家在组织工程方面已实施了973基础研究项目。对各种可模拟微重力效应装置的需求正在不断的增加。相信不久将来在这方面会有所进展和突破。
我国研究情况
我国空间细胞培养研究经历了一个比较长的起始发展阶段，1988年8月5-13号，我国首次进行了高等哺乳动物细胞的卫星搭载试验，细胞样品被培养在平底塑料管中，培养温度与卫星舱内同步，总体积6毫升。1990年10月5-13号，在第二次细胞飞行试验中，培养条件有所改善，细胞生长在玻璃培养瓶内，总体积35毫升;培养瓶放在有温控材料控温的培养罐内，培养温度为36±1℃，罐内设有遥测通道。由于空间环境的复杂性，空间的实际情况与地面条件下的模拟和计算结果有较大出入，温控装置未能按原定计划工作，它实际上仅提供了约4天的正常生长温度，仅有极少量癌细胞成活。1992年10月7-14号第三次卫星搭载试验时，细胞培养条件在原来的基础上增加了一组电池和加热板，从而保证了一定的温度条件，初步取得了较好的试验结果。1994年7月3-18号第五次卫星搭载试验时，小鼠腹腔巨噬细胞和杂交瘤细胞样品第一次在较好的生长条件下进行培养。细胞生长在改良的动态细胞培养系统内，该系统包含两个细胞反应器，每一个反应器中有培养液储存系统，换液系统，两个细胞培养室及气室。气室中初始气体为含8%CO2、25%O2的混合气体;气室与培养室之间有一层可以进行气体交换的薄膜相隔。每一反应器中有一个培养室，由渗透泵驱动换液，培养液流速大约为60微升/天，称为流动培养室。另一个非换液室称为静止培养室。温控装置维持培养室内温度约为36±1℃，培养液储存室温度约为15±2°C。经过15天的空问飞行试验表明我国自行研制的这一装置基本适合巨噬细胞的培养，贴附在微载体上的巨噬细胞在改良的动态培养系统内存活良好。装置还需要进一步改进和完善。目前，一个更高水平和更大容量的细胞反应器正在研制中。