在这个同盟成立后不久，雅典开始为了自身利益而利用同盟的海军。这种行为经常导致[[雅典]]和同盟内其他弱势成员之间产生冲突。而斯巴达并不乐见雅典扩张霸权，建立了[[伯罗奔尼撒联盟]]与提洛同盟对抗。在公元前431年，两大同盟爆发战争，史称伯罗奔尼撒战争，公元前404年，提洛同盟战败而解散。

希腊城邦雅典和[[埃雷特里亚]]也加入到了由阿里斯塔格拉斯引起的这场斗争中，在他们唯一的战役季节（公元前498年）期间，也促成了对波斯萨第斯地区的首府进行掠夺和烧毁。在这之后，爱奥尼亚起义持续了五年（没有了其他外在援助），最终被波斯帝国完全镇压。然而在此之后，[[波斯]]国王大流士大帝做出一个具有重大历史意义的决定，尽管已经成功压制了这场起义，还要继续对支持这场起义的雅典和埃雷特里亚施加惩罚。[[爱奥尼亚起义]]已经严重威胁到了大流士帝国的稳定，如不加以解决，希腊主要城邦地区还将继续对波斯形成威胁。大流士大帝以侵略雅典和埃雷特里亚为开始，计划完全征服希腊。

在公元前480年，[[薛西斯一世]]亲自领导了第二次入侵希腊战争，带领了大量（尽管经常被夸大）的陆军和海军前往希腊。在两个同时进行的[[温泉关战役]]和阿提密西安海战中，选择抵抗的希腊人（“同盟军”）被打败了。除了伯罗奔尼撒半岛外的希腊其他地区都落入了波斯人的手中，波斯人试图一次完全终结同盟军，但在非常关键的萨拉米斯战役中战败。第二年，也就是公元前479年，同盟军集结了当时最庞大的希腊军队，在普拉提亚战役中击退了波斯入侵军队，结束了这次入侵以及其对希腊的威胁。

据说，同盟军的舰队在与[[普拉提亚战役]]同一天的米卡勒战役中，打败了士气低落的波斯舰队的残兵剩将。这次战役标志着波斯帝国第二次入侵的结束，希波战争步入一个新的阶段——希腊反击阶段。在米卡勒战役后，小亚细亚的希腊城邦再次发动起义，而波斯人已无力阻止。同盟军舰队开到了仍受波斯控制的色雷斯[[加利波利半岛]]，包围和占领了塞斯托斯。在第二年的公元前478年，同盟军派出军队去占领拜占庭（现在的[[伊斯坦布尔]]）。这次围攻取得了成功，但是斯巴达的将军普萨尼亚斯的行为疏远了许多同盟军，最终导致鲍桑尼亚将他召回。