PfuDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶
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PfuDNA聚合酶（Pfu DNA polymerase），又称Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一类能在活体内进行DNA复制的酶。该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50),为多聚体,分子量约为90kDa。该酶同时具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性,因此在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基,忠实性极高。体外实验中，在聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）中，使用Pfu聚合酶可以快速，高保真的扩增DNA片段。

Sso7d是来源于Sulfolobus solfataricus的一种双链DNA结合蛋白,与DNA聚合酶融合后,聚合酶的进行性得到了显著的提升,而其对聚合酶催化活性和热稳定性没有影响。

Pfu聚合酶的校正作用

与其它在PCR反应中使用的聚合酶相比，Pfu聚合酶有着出色的热稳定性，以及特有的“校正作用”。与TaqDNA聚合酶不同，PfuDNA聚合酶具有3'-5'外切酶的即时校正活性，可以即时的识别并切除错配核苷酸。因此，使用PfuDNA聚合酶进行PCR反应，比使用Taq聚合酶有较低的错配突变几率，保真性更高。Pfu聚合酶正逐渐取代Taq聚合酶，成为使用最广的PCR工具。

商业化的Pfu聚合酶试剂，其出错率是100万到130万个碱基对出现一个错配，使用PCR每扩增1kb的DNA片段会产生2.6%的突变产物。但缺点是，Pfu聚合酶的效率较低。一般来说，在72° C扩增1kb的DNA时，每个循环需要1到2分钟。而且使用Pfu聚合酶进行PCR反应，会产生钝性末端的PCR产物。

Pfu聚合酶常常用于保真性要求较高的DNA合成中。有报道说，Pfu聚合酶与Taq聚合酶联合使用，既能达到Pfu聚合酶的高保真性，又能发挥Taq聚合酶的快速聚合活性。

补充：

此酶催化DNA合成的忠实性比Taq酶高12倍，最适延伸温度为72~78摄氏度，PfuDNA聚合酶耐热性极好，97.5摄氏度时的半衰期大于3小时。在无dNTP时，PfuDNA聚合酶会降解模板DNA，因此反应时一定要最后加入该酶到反应的混合物中。由于该酶加入低盐缓冲液。

20mmol/LTris.HCl,

pH8.2,

10mmol/LKCl,

6mmol/L硫酸铵

1.5mmol/L氯化镁

0.1%Triton X-100,

10ng/ulBSA

退火温度比Taq酶低，约在37~45摄氏度之间，加入1%~5%甘油，或者DMSO可以提高该酶催化的PCR产量。

一般耐热DNA聚合酶扩增片段长度小于5kb，是PCR技术应用受到一定限制。Boehringer公司新近推出一种Expand 长片段扩增系统，其扩增片段可长达40kb。

Pfu聚合酶链式反应的作用与优点

聚合酶链式反应,因为其方便,快捷,准确地大规模复制目的基因片段的能力,已经成为了分子生物学不可或缺的技术手段,其在人类基因组计划以及后续的人类蛋白质组计划中都起着不可替代的作用。至其诞生以来,在全世界各国科学家的共同努力下,该技术已经获得的长足的进步。如热循环仪的发明,大大节约了反应时间,节省了研究者的精力;逆转录聚合酶链式反应则可用于检测细胞/组织中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等;实时定量聚合酶链式反应的发明,则使得精确定量测定特定DNA片段个拷贝数成为可能。如今,该技术凭借其诸多优势,在诸多领域,如医学检测、感染性疾病检测、法医学检测分子进化等,成为无法取代的技术手段。作为聚合酶链式反应中的核心工具,DNA聚合酶在聚合反应中极为重要,其性能会直接影响产物的特异性、产量、保真性等各种特性。因此,高性能的DNA聚合酶的获得对分子生物学实验来所就显得非常关键。通过筛选高性能热稳定性聚合酶、融合特定辅助_蛋白、选择合适的表达系统、优化蛋白表达及纯化、降低成本等方法,科学家希望获得性质更加稳定高效,成本更加低廉的DNA聚合酶。