DNA克隆

         

DNA克隆

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应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。

目录

克隆过程

一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。

目的基因获取

利用重组DNA技术构建嵌合DNA时，欲插入载体DNA的外源DNA片段中含有我们感兴趣的基因或DNA序列—目的基因。获取目的基因大致有如下几种途径或来源。

化学合成法

如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列后，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。

基因组DNA

分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。存在于细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)。基因组DNA文库就象图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因文库后需要结合适当筛选方法从众多转化子菌落中筛选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的无性繁殖系—克隆。

cDNA

以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(complementary DNA，cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受菌体，扩增为cDNA文库(cDNA library)，然后再采用适当方法从cDNA文库种筛选出目的cDNA。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包括了细胞全部mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。

选择与构建

外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连接到复制子上，外源DNA则可做为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体。重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一项极富技术性的专门工作，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

导入受体菌

外源DNA（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子（嵌合DNA）后，需将其导入受体菌。随着受体菌的生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖；筛选出的含目的DNA的重组体分子即为一无性繁殖系或克隆。在选择适当的受体菌后，经特殊方法处理，使之成感受态细胞 (competent cell)，即具备接受外源DNA的能力。根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化(transformation)、转染(transfection)和感染(infection)等不同手段。