CDNA

         

CDNA

[1]來自 搜狗 的圖片

cDNA 是指互補(有時稱拷貝)DNA。特指在體外經過逆轉錄後與RNA互補的DNA鏈。與平常我們所稱謂的基因組DNA不同，cDNA沒有內含子而只有外顯子的序列 。真核生物的mRNA或其他RNA的cDNA，在遺傳工程方面廣為應用。

目錄

簡介

cDNA是指具有與某RNA鏈呈互補鹼基序列的DNA。與RNA鏈互補的單鏈DNA，以其RNA為模板，在適當引物的存在下，由依賴RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）作用而合成，並且在合成單鏈cDNA後，再用鹼處理除去與其對應的RNA以後，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶或依賴RNA的DNA聚合酶作用合成雙鏈cDNA。在這種情況下，mRNA的cDNA，與原來的基因組DNA相同而且無內含子；相反地，對應於在原來基因中沒有的而在mRNA存在的3'末端的poly A序列等的核苷序列上，與外顯子序列、先導序列以及後續序列等一起反映出mRNA結構。

遺傳控制中最大的困難並不是DNA的克隆，而是需要被克隆的特異DNA片段的分離 。如果以克隆基因為目的，特異DNA片段的分離將大大有助於獲得與遺傳信息同樣多的相關的基因產物，一般說這些基因產物均為蛋白質多肽，因此抗該蛋白質的抗體對於測定和沉澱蛋白質及其前體有重要用途，甚至可用於了解蛋白質分子量

製備cDNA

製備互補DNA，往往需要先分離從目的基因轉錄來的mRNA.如果該基因編碼的蛋白質是細胞中的主要蛋白質，則此基因的產物是總mRNA的主要組成部分 [2] 。就胰島B細胞而論，此細胞含有高水平胰島素前體mRNA，後者有時可以沉澱正在翻譯的mRNA的核糖核蛋白體，如果用特異抗體結合所表達的蛋白質(抗原)，則可從沉澱的核糖體中分離出胰島素特異的mRNA，一般特異mRNA只是細胞總mRNA中的次要成分。在這種情況下，不得不以密度梯度離心，按分子量大小把總mRNA分開，然後把分離開的mRNA直接用於試管中表達蛋白質(用家兔網織細胞的溶胞產物或小麥胚芽提取物作為翻譯系統的誘導物)再用免疫沉澱或聚丙烯酰胺凝膠電泳從許多表達的蛋白中測定出目的蛋白，從而確定表達該蛋白的特異mRNA。

合成步驟

1．cDNA第一鏈的合成

所有合成cDNA第一條鏈的方法都要用依賴於RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應，主要有兩個關鍵因素，一個是mRNA模板，另一個是反轉錄酶 。商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒（AMV）逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒（MLV）反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括2個具有若干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴於RNA的DNA合成，依賴於DNA的DNA合成以及對DNA-RNA雜交體的RNA部分進行內切降解（RNA酶H活性）。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基，兼備依賴於RNA和依賴於DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA雜交體中的RNA的能力較弱。且其熱穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的eDNA（如大於2～3kb）。AMV反轉錄酶和MI。V反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH、最適鹽濃度和最適溫度各不相同．所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要的。

AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3』端poly（A）結合的12～18個核苷酸長的oligo（dT）。

cDNA克隆

cDNA克隆( cDNA cloing)與RNA互補的雙鏈DNA片段，而且它能攜在克隆載體中。通常用於克隆真核生物mRNA的DNA拷貝。由於cDNA持貝是一個成熟的信息分子拷貝，因此，無內含子順序。如果在其克隆的藏體中連上一個適當的活動子序，它可在任何宿主體內得以迅速表達