流式細胞術
| 流式細胞術 |
流式細胞術是一種生物學技術，用於對懸浮於流體中的微小顆粒進行計數和分選。這種技術可以用來對流過光學或電子檢測器的一個個細胞進行連續的多種參數分析。 流式細胞術（Flow CytoMetry，FCM）是對懸液中的單細胞或其他生物粒子,通過檢測標記的熒光信號，實現高速、逐一的細胞定量分析和分選的技術。
目錄
基本信息
中文名; 流式細胞術
外文名; Flow Cytometry, FCM
優點; 速度快、精度高、準確性好等
作用; 快速測定細胞或細胞器生物學性質
特點; 測量速度快；2.可進行多參數測量
最高速度; 每秒鐘3萬個細胞
信息簡介
一種在液流系統中，快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質，並把特定的細胞或細胞器從
群體中加以分類收集的技術。其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細胞 DNA含量、細胞體積、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數。根據這些參數將不同性質的細胞分開，以獲得供生物學和醫學研究用的純細胞群體。目前最高分選速度已達到每秒鐘3萬個細胞。
主要特點
1.測量速度快；2.可進行多參數測量；3.是一門綜合性的高科技方法（ FCM綜合了光學，電子學，流體力學，細胞化學，免疫學，激光和計算機等多門學科和技術）；4.既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。
工作原理
將待測細胞染色後製成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷
酸緩衝液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞着樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。
流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形後的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。
這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收後可轉換為電信號，再通過模/數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，也可以打印出來，還可以數據文件的形式存儲在硬盤上以備日後的查詢或進一步分析。
檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數，這視其模數轉換器的分辨率而定。對於雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。
細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電後振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。
應用範圍
隨着對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走入了臨床應用階段，在我國臨床醫學領域裡已有着廣泛的應用。可用於白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學研究，並已開
始用於細菌鑑定，病毒感染細胞的識別和艾滋病感染者T4、T8細胞的計數。
自70年代以來，隨着流式細胞技術水平的不斷提高，其應用範圍也日益廣泛。流式細胞術已普遍應用於免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學研究領域。
在腫瘤學中的應用
這是FCM在臨床醫學中應用最早的一個領域。首先需要把實體瘤組織解聚、分散製備成單細胞懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色後對細胞的DNA含量進行分析，將不易區分的群體細胞分成三個亞群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。
(1)發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷：人體正常組織發生癌變要經過一個由量變到質變的漫長過程，而癌前細胞即處於量變過程中向癌細胞轉化階段。人體正常的體細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變，FCM可精確定量DNA含量的改變，作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標誌，能對癌前病變的性質及發展趨勢作出估價，有助於癌變的早期診斷。有資料證實，癌前病變的癌變發生率與細胞不典型增生程度有密切關係，增生程度越重，癌變發生率越高。隨着細胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍體出現率增高，這是癌變的一個重要標誌。
(2)在腫瘤的診斷、預後判斷和治療中的作用：FCM在腫瘤診斷中的重要作用已經被認可，DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據，FCM分析病理細胞具有速度快、信息量大，敏感度高等優點，已被用在常規工作中。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預後的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預後則較好。
FCM不僅可對惡性腫瘤DNA含量進行分析，還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效，了解細胞動力學變化，對腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫師可以根據細胞周期各時相的分布情況，依據化療藥物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳的治療方案，從DNA直方圖直接地看到瘤細胞的殺傷變化，及時選用有效的藥物，對瘤細胞達到最大的殺傷效果。
此外FCM近幾年還被應用於細胞凋亡和多藥耐藥基因的研究中[3，4]。醫學工作者開始研究如何用藥物誘導癌細胞死亡。通過對細胞體積、光散射、DNA含量及特異性抗原基因(如bcl-2, Fas等)測定分析出細胞凋亡情況。多藥耐藥是腫瘤病人化療失敗的主要原因，FCM對多藥耐藥基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定，可為臨床治療效果分析提供有力依據。
在臨床中的作用
FCM通過熒光抗原抗體檢測技術對細胞表面抗原分析，進行細胞分類和亞群分析。這一技術對於人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。有大量文章介紹了淋巴細胞亞群等在各種疾病中的變化。正常人群淋巴細胞T4/T8比值大約為2∶1，但在人體細胞免疫力低下時可出現比例倒置。用FCM還可以監測腎移植後病人的腎排斥反應，如果T4/T8比例倒置，病人預後良好，較少發生腎排異現象；反之排異危險性增加。同樣此種測定技術也用於艾滋病的診斷和治療中。還有作者報告了外周血淋巴細胞免疫表型的參考值，並對其種族、性別、年齡等影響因素進行了探討[5]。
目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經發展到了百餘種，可以對各種血細胞和組織細胞的表型進行測定分析。
在血液病診斷和治療中的應用
FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對各種血液病的診斷、預後判斷和治療起着舉足輕重的作用。
(1)白血病的診斷和治療：FCM採用各種抗血細胞表面分化抗原(CD)的單克隆抗體，藉助於各種熒光染料(異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等)測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病的診斷和鑑別診斷有決定性作用[6]。例如幹細胞表達CD34，髓系表達CD13、CD14，B細胞系表達CD10、CD19、CD20等，T細胞系表達CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以測定出血細胞表達各種抗原的水平，協助臨床確診。
同其它腫瘤的治療一樣，測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況採取相應藥物可以提高療效。
目前臨床除化療藥物治療外還採用造血幹細胞移植技術治療急性白血病和一些疑難性疾病[7]。FCM通過對人白細胞抗原(HLA)配型的測定可以為異體幹細胞移植病人選擇出最合適的供體。造血幹細胞移植技術主要包括幹細胞的鑑別、活性測定、幹細胞動員和採集、分離純化、保存擴增、腫瘤細胞的淨化、幹細胞回輸以及術後保持移植物抗宿主病的低發生率等一系列過程。FCM測定CD34、HLA-DR、CD33等細胞表面標誌物，成為幹細胞移植技術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預後做出早期的判斷。
(2)其它種類血液病的診斷和治療監測：陣發性睡眠性血紅蛋白尿症是一種造血幹細胞克隆病，細胞CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬於血細胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊複合物的形成，從而抑制細胞被補體激活溶解。FCM採用熒光標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷並判斷疾病的嚴重程度[8]。
(3)網織紅細胞的測定及臨床應用：網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標，FCM通過某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等)與紅細胞中RNA結合，定量測定網織紅細胞中RNA，得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有作者報道FCM方法比目測法結果精確度更高[9]。此外FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義[10]。為幹細胞移植術後恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤病人放化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。
在血栓與出血性疾病中的應用
(1)血小板功能的測定：正常情況下血小板以分散狀態在血管內運行，但當血管損傷、血流改變或受到化學物質刺激時血小板被活化而發生一系列改變。由於血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種新手段[11]。該方法靈敏、特異性高。如果採用全血法測定，只需微量標本，適合於兒童及血小板減少性疾病的患者[12]。 血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變，FCM可以通過單抗免疫熒光標記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)監測血小板功能及活化情況，有利於血栓栓塞性疾病的診斷和治療。
此外血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化，藉助於鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。(2)血小板相關抗體的測定：免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產生血小板自身抗體，結合在血小板表面，稱為血小板相關抗體，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板，FCM可以測定血小板相關抗體含量。直接法檢測血小板表面的相關抗體，間接法可測定血清中的相關抗體。該方法用於該病的診斷及治療監測，具有檢測速度快、靈敏度高的優點。
質量控制
一、流式細胞儀的校準
流式細胞儀的校準包括流路的穩定性、光路的穩定性、多色標記熒光顏色補償、光電倍增管轉換的線性和穩定性。對儀器的校準主要是利用標準微球進行監測。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒光標記或者擁有定量免疫球蛋白的結合位點。這種製成固定熒光強度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式質控中的一個常用的標準品。
二、實驗操作過程的質控
1、樣本的質量控制
用於流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質控最困難的環節之一。每種樣本都有不同的採集、保存、運輸和製備要求。首先，觀測樣本外觀：有嚴重溶血、凝聚或壞死的樣本應棄用。
第二，單細胞懸液的獲取：外周血和骨髓穿刺液為天然單細胞懸液；活檢組織常用機械分離和酶消化兩種方法。不同的實驗要求適用不同的方法。對於需要進行膜抗原標記的，不僅是要獲得足夠的單細胞懸液，還要儘量保證細胞結構的完整性和抗原性，機械法較適用。只需進行細胞周期或DNA倍體分析的，在機械法的基礎上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）較適用。
第三，抗凝劑的選擇：外周血標本可採用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數和流式分析，則應用EDTA抗凝；對於血小板分析的實驗，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由於相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。
第四，樣本的保存：理想狀態下，樣本應在採集後立刻進行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時/室溫（16-25）；對於只作胞內染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但此「固定－染色」的方法取決於要分析的抗原特性和染色方式。
第五，去除紅細胞的方法：紅細胞裂解法，操作簡單、快、並最可能保持原始標本的白細胞分布。最好在染色後溶血。若在染色前溶血，需確認：（1）抗原性不被溶血過程改變；（2）溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結合的動力反應未受影響；（3）所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細胞活性及表面標記結果。密度梯度離心法，靶細胞回收較好並可能得到富集，同時去除紅細胞、碎片等，但費時，某些重要細胞群體可能被選擇性丟失。
第六，細胞與抗體的比例：廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細胞數量在5X105 ~1x106範圍內。有些標本沒有足夠的細胞，有些則由於細胞量大，正常濃度下的抗體相對過量或不足，導致假陽性或假陰性結果。因此，每個實驗室應根據不同於廠家推薦的方法，調整細胞與抗體用量，得到最適的細胞/抗體比例。
第七，細胞活性的鑑定：死細胞對許多抗體均有很強的非特異性染色，這就使樣本細胞活性檢測變得非常重要，尤其是經過了長時間運輸和儲存的樣本。檢測的方法通常有兩種：（1）實時的流式檢測：利用熒光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放線菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）進行死細胞染色，而活細胞拒染這些染料。此方法的優勢是細胞表面標誌和活性分析可同時進行。尤其適用於高度壞死的樣本。7-AAD最常用，因為在488nm激發下，其最大發射光在670nm左右，適合與FITC 或PE進行多色標記。但隨着時間延長，7AAD會在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區分變得困難。因此，對於染色並在固定後12小時以上分析的標本，最好用EMA。EMA與死細胞DNA穩定的共價結合保證了長時間固定後仍能很好地區分固定前的死活狀態。（2）手工檢測：使用Trypan blue 或其他細胞活性染料。（3）使用專門的儀器進行檢測。如Vi-cell.
2、選擇和確定單抗組合
流式分析最基本的試劑就是抗體。所選抗體的好壞直接影響結果。影響抗體特性的因素很多，如F/P比值、亞型、全長或片段、種宿來源、標記熒光種類等等。而且，有CD分類號的300多種單抗和大量沒有CD分類號的單抗使抗體的選擇更加困難。一般，選擇抗體組合遵循以下基本原則：1）所選的抗體組合應足夠寬，可以鑑別樣本中的所有細胞亞群包括正常和異常群體。2）對表達少的抗原應儘可能選擇熒光強度強的熒光素標記。3）了解不同抗體的細胞反應譜，以及染色模式。根據不同的實驗目的選擇抗體。因為相同CD編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。4）抗體的多種組合可能相互影響與抗原的結合（如通過空間構型的阻礙），所以對所用抗體組合，應先了解每個抗體在對照細胞上單色標記的表達情況。5）對於臨床實驗儘量選擇體外診斷（IVD）試劑和分析特異性（ASR）試劑，而僅供研究用（RUO）試劑一般不能用於體外診斷實驗。在我國，用於體外診斷的試劑還必須取得國內的SDA認證。這樣，一個抗體組合內的抗體可能來源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型、不同F/P值，可能均需要自身的同型對照，而實際上，這是非常困難的。那麼，儘量選擇同一家公司的試劑可以減少上述的干擾。對於臨床上常見的流式檢測項目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合。
如，T細胞亞群檢測的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；陣發性血紅蛋白尿（PNH）檢測的CD55、CD59；血小板無力症（GT）檢測的CD41、CD61等等。但對於白血病/淋巴瘤免疫分型，國際上迄今為止也沒有統一的抗體組合。在2000年國際細胞分析學會（ISAC）大會上，臨床血細胞計數協會組織了一次國際專家會議，以期對檢測血液淋巴系統腫瘤所需最少、最有效的單抗數達成共識。75%與會者一致認為，對於慢性淋巴系統增殖性疾病（CLD）有9種單抗：CD5,CD19, κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45對初診來說是最基本的。淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16種單抗。對於急性白血病（AL），75%的與會者認為大約13-15種單抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，對初步鑑別白血病系列是必需的。其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能對某些病例有用。幾乎所有的投票者都認為，要對急性白血病完善分類所需單抗的恰當數量平均為20-24種。但這些抗體之間組合也是一大難題，目前也無統一規定（如表二）。大會多數發言者(11/13)指出，對已確診病人的監護和分期來說，僅需較少單抗。
抗體的質量控制是實驗的關鍵環節。抗體的質量包括其特異性、靈敏度、精密度。對這一些，一些商業化的公司對常用單抗的檢驗均推出了一系列質控物。如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（見表一）。
3、染色方法
細胞表面染色：大多數免疫表型分析均採用此方法。但由於許多抗原也同時存在細胞內，所以在細胞表面抗原檢測時應特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。表面標記又分溶血前標記和溶血後標記。若紅細胞對標記有影響或血漿成分對標記有影響的，適合溶血後標記，但要注意溶血劑膜抗原的影響，所以，溶血劑一般不含固定劑。如免疫球蛋白輕鏈檢測和陣發性血紅蛋白尿的檢測等。
細胞內染色：有些胞內抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。胞內染色的關鍵是使細胞膜通透，把抗體或核酸染料導入胞內而不影響細胞骨架的完整性。還要保證固定和透膜的步驟不影響有關抗原與相應抗體的結合力和核酸與染料的結合。某些適用於胞內染色的試劑可能不適於表面標記分析。通常胞內染色不能與細胞活性的檢測同時進行，除非用EMA的方法。對於胞內染色，所用的熒光素應足夠小到能穿透到胞膜內。對於某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）為活細胞染料，無需固定或透膜。
胞膜和胞內染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內染色，最後是DNA染色。
三、數據的獲取和分析
流式細胞儀數據的獲取必須是在儀器性能的校準均合格的基礎上進行。由於流式細胞儀是基於對散射光信號和熒光信號進行分析的儀器，因此，儀器散射光和熒光信號的光電倍增管電壓、增益、顏色補償等參數的設定直接影響結果。同型對照的設定尤為重要。同型對照是指與單抗種宿來源相同、亞型相同、標記熒光素相同的未免疫動物的免疫球蛋白。同時考慮濃度、F/P值儘量相同，這樣陽性閾值的界定才比較準確，特別是對於弱表達抗原陽性率的測定。而DNA倍體分析中參照物的設定非常重要，一般雞紅細胞作為內參照物。為了結果的可靠性，對獲取的細胞量至少應在10000-20000個。但不同的實驗目的對於獲取的細胞量要求一般是不一樣的，如DNA倍體分析，至少應獲取10000個細胞；微小殘留病灶（MRD）的檢測，要求達到10-4數量級水平，則應至少分析100000個細胞幹細胞移植中CD34的檢測，應至少獲取100個CD34陽性細胞或75000個有核細胞。
對於獲取的數據，應保存在listmode文件中，便於分析。設門（gating）對於流式數據分析至關重要。設門實際就是確定分析區域。在DNA倍體分析中，設門實際就是圈定單個細胞，排除粘連細胞。對於細胞成分單一的標本（如培養細胞），設門比較簡單。但對於成分複雜的標本（如骨髓）而言，準確的設門就不那麼簡單。前向散射光（FS）與側向散射光（SS）設門干擾因素較多，目前，越來越多的被免疫標記物加散射光設門所取代。如，CD45/SS設門已成為白血病/淋巴瘤免疫分型、CD34檢測、MRD監測最佳的設門方法；CD19/SS設門對於成熟B淋系增生性疾病分析非常適用。
在數據分析中，百分率、熒光強度、DNA指數（DI）、多少個/ul是我們報告中常用的。百分率主要適用於檢驗指標集中在細胞有無的數量變化。如T細胞亞群檢測、網織紅細胞檢測等；熒光強度主要適用於檢驗指標的變化集中在細胞上抗原量的多少。如血小板無力症（GT）的檢測、慢性淋巴細胞白血病（CLL）CD20的變化等。DI用於DNA倍體分析。而愛滋病劃分中外周血CD4的絕對定量、OKT3治療監測中CD3的絕對定量、幹細胞移植中的CD34的定量等等，最終都以多少個/ul的濃度形式表示出來。對於白血病/淋巴瘤免疫分型結果的分析，以前基本上都是以百分率的形式報告臨床，但單純的百分率結果並不能完整的反映腫瘤細胞的特性。因為20%人為認定的陽性判斷標準忽略了低於20%的弱陽性結果，以及忽略了陽性結果之間熒光強弱的差別，而這一切對於白血病/淋巴瘤的診斷和分型卻非常重要。目前，大多主張以文字描述抗原有無和強弱的報告方式，廢棄百分率的報告形式。
四、臨床檢驗的分析過程的質量評價
質量控制也必須重視檢驗方法學的選擇和評價。任何一次實驗都一定有誤差，在一定意義上可以將誤差分為實驗方法學的系統誤差及除此之外的隨機誤差。質量控制的方法和手段都只能減少或消除隨機誤差，但不影響系統誤差。要使檢驗結果的誤差控制在臨床可接受的低水平或者允許的誤差範圍內，必須使用總誤差水平符合臨床要求的檢驗方法（包括儀器、試劑、具體操作方法等），才能保證檢驗結果在質量控制下符合臨床要求。臨床檢驗質量控制的目的，是監測實驗過程中出現重要的誤差時，用適當的方法警告分析人員。一般說來，檢查實驗結果質量的方法是測定質控物，最通用做法是將質控品和病人一起進行常規檢驗，了解檢驗質量則是將質控品測定的結果畫在控制圖上，觀測控制結果是否超過控制限來決定失控與否。
在開始使用質控物的第一個月內，檢驗人員每天將質控物隨機插入病人標本中進行檢驗項目的測定。月末對當月的測定結果（n≥20）做簡單統計，求出均值x和標準差s。若檢驗結果的分布接近正態分布，結果的分布即可用均值和標準差來描述。這就意味着95.5%的結果在x+2s範圍內,99.7%的結果在x+3s範圍內。為便於觀察質控結果，及時了解有何失效情況，常使用質控圖。
按照正態分布規律：1)所有測定值應均勻分布於均值兩側，不應有明顯不均之感；2)質控品測定值應有95.5%的可能性在x±2s範圍之內； 3)不應有連續6次以上的結果落於平均值的一側；4)不能有連續5次以上的結果有逐漸增高或降低的趨勢性變化;5)不應有連續兩次結果在x±2s範圍之外； 6)沒有一次結果在x±3s範圍之外。
如果不符合上述規律，則說明結果失控。只有證實當天質控結果在控制之內,對當天的臨床檢驗才能發出結果。一旦出現失控,則須查明原因，重新檢驗。對有1次檢驗結果超出均數2個標準差範圍，提示警告。同批實驗中2個質控品的結果之差值超過4s，也是失控規則之一，提示存在隨機誤差。連續4次質控結果同方向超出均數1個標準差範圍，也是失控規則之一，提示存在系統誤差。
五、室間質量評價
開展內部的質量控制使實驗的受控項目達到一定的精密度。臨床上往往只對實驗結果是否可重複較敏感，若實驗結果存在較穩定的系統誤差，臨床和實驗室一般不易察覺，因此內部的質量控制還在於控制結果的不精密度。由專門機構定期向臨床實驗室分發質控品,要求各單位檢測後返回測定結果，經過整理和統計，以數據和報告形式反映各實驗室間及各分析方法間的差異，根據各單位測定結果與靶值的離散程度，計算出該實驗室所的分數，及時反饋給參加者，便於改進工作。這就是室間質量評價的基本形式。室間質量評價主要是控制實驗室工作的不準確度，是對室內質量控制的補充。我國於2000年，由衛生部臨床檢驗中心開始組織開展臨床流式細胞術室間質評。現已開展了T細胞亞群檢測和CD34絕對計數的室間質評。
技術特點
流式細胞儀作為一種最先進的細胞定量分析檢測儀器，設計上採用了許多獨特的技術，其中涉及到液流系統、光路系統、信號測量和細胞分選等4個方面。
展望信息
流式細胞儀從細胞技術開始發展到今天，60年代至70年代是其飛速發展時期，
激光技術、噴射技術以及計算機的應用使流式細胞儀在原理和結構上形成了固定的模式。
80年代則是流式細胞儀的商品化時期，這期間不斷有新型號的儀器推出，在多參數檢測技術上不斷提高。
進入90年代，隨着微電子技術特別是計算機技術的發展，計算能力不斷提高，流式細胞儀的功能也越來越強大。在數據管理、數據分析方面有了長足進步。但是，在技術原理和設計方面並沒有突破性的進展。人們的注意力開始轉向流式細胞儀的應用，新的熒光探針、新的熒光染料、新的染色方法不斷推出，使流式細胞技術在新的細胞參數分析方面日益發展。
從新推出的儀器看，流式細胞儀會在硬件上不斷更新，採用更新的器件（如半導體激光、大規模集成電路），以實現小型化；用數字電路取代模擬電路，充分發揮微處理器的功能以實現簡單化；在軟件上提高數據自動分析能力，充分發揮圖形界面的優點，使操作更加簡便。
目前，FCM是定量外周血中HPC的參考方法，廣泛應用於外周血幹細胞移植實驗室，用於決定PBSC採集的時機及評價外周血採集液的收益。其基本原理為熒光免疫分析，即根據外周血與骨髓中HPC表達同樣的CD34抗原(CD34+)，並利用熒光標記CD34抗體與HPC膜表面CD34抗原結合，在特定波長的激光照射下，檢測CD34+胞發出的熒光強度並結合其光學特性，即較低的側向散射（SSC）和較高的前向散射（FSC），從而檢測CD34+細胞。CD34+細胞實際上包括所有的HPC，如CFU-GM，紅細胞暴發形成單位(BFU-E),巨核細胞形成單位（CFU-Mk）,混合細胞集落形成單位（CFU-Mix）和原始細胞集落形成單位（CFU-Blast）。後兩種HPC明顯具有許多幹細胞的特徵，如它們可以自我更新，也可定向分化為一定數目的造血細胞系。體內試驗也發現，經過致死劑量照射的狒狒移植足夠數量的自體CD34+細胞，可以完全恢復其造血功能，同樣的現象也可在經過骨髓、摧毀性治療的病人中出現。有人認為，CD34+細胞在功能上可根據是否表達CD33抗原而分為2個細胞群。早期的HPC，如CFU-Blast和LTC-IC僅表達Q CD34抗原（CD34+/CD33-），而較為成熟的定向祖細胞可同時表達CD34和CD33抗原（CD34+/CD33+）。還有人根據CD38抗原表達與否，將CD34+細胞分為CD34+/CD38-和CD34+/CD38+兩個亞型，並且認為LTC-IC主要分布於CD34+/CD38-亞型，而更為原始的ELTC-IC則僅分布於CD34+/CD28-細胞群，說明CD34+/CD38-亞型性質上更接近PBSC。
回顧性資料表面，移植經歷了與移植物中不同分化程度的HPC有關的兩個階段。起初，與早期造血恢復有關的是移植 物中定向祖 細胞（committed progenitor cell）；繼之，持續性的移植 相由多能造血幹細胞產生。因此，周血中不同分化程度的HPC，對指導幹細胞採集及移植成功尤為必要。目前多參數及雙參數流式細胞低度均可通過CD34、CD33和CD38抗體等檢測標本中不 同CD34+細胞亞型，來決定採血的時機和預測移植效果。Barnett等報道，採集液CD34+細胞數量與外周血中CD34+細胞百分率顯著相關（r=0.71），並且認為準確計數循環中CD34+細胞，可更好地預測採集液中造血干/祖 細胞含量。Weaver等觀察692例患者外周血祖細胞（PBPC）採集液中CD34+細胞、單個核細胞、集落形成單位的數量與移植動力學關係，認為PBPC採集液中CD34+細胞含量是預移植後中性粒細胞和血小板數量回升最有力的指標。
雖然，FCM測定CD34+細胞是檢測HPC數量的參考方法，但仍有一些技術問題有待解決：
（1）單平台分析代替傳統雙平台分析的可行性；
（2）應對單平台FCM分析實驗室進行多中心的橫向研究；
（3）標本製備方法；
（4）確定引起移植後快速和長期造血功能恢復的不同幹細胞亞型及移植所需數目等。
此外，FCM法需特殊儀器，操作技術要求高，價格昂貴，結果的重複性欠佳，促使人們追求更經濟、快捷、簡便的方法。
圖書情況
圖書信息; 叢書名： 藥學實驗室技術系列
作 者： 賈永蕊 編
出版時間： 2009-3-1
版 次： 1
頁 數： 183
開 本： 16開
包 裝： 平裝
所屬分類： 圖書 >> 醫學 >> 藥學 >> 藥學理論
內容簡介
本書分為三篇，原理篇主要介紹了流式細胞術的原理和質量控制方法；操作篇詳細地介紹了流式細胞術細胞懸液的製備，以及在具體的各項應用中流式細胞術的操作方法與技巧：常見問題解答篇採用一問一答的方式，根據編寫人員的實踐經驗，對流式細胞術中常見的問題進行詳細解答。
內容涉及，應用流式細胞術進行：
細胞周期禾口DNA倍體分析
DNA雙參數分析
凋亡檢測
腫瘤細胞多藥耐藥檢測
細胞免疫表型分析
細胞因子的測定
與同類書相比，本書更加以實際經驗為基礎，突出實際操作技巧，採取Step-by-Step方式進行說明，使方法與技巧更易於掌握。
本書適用干醫藥、生命科學相關實驗室的技術人員及相關研究生。 <ref>流式檢測細胞周期操作步驟, 鞍山新聞說,2018-09-23