反向PCR
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PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增一段已知序列的兩端未知序列。 反向PCR的目的在於擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。
- 中文名:反向PCR
- 外文名:Reverse PCR
- 適用領域:基因研究
- 所屬學科:生物學
目錄
原理
反向PCR可用於研究與已知DNA區段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區兩末端序列互補，但兩引物3』端是相互反向的。擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA，然後用DNA連接酶連接成一個環狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現已製備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對於轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。
不足之處
該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數有核基因組含有大量中度和高度重複序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。
其他用途
利用反向PCR可對未知序列擴增後進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，並可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用於基因遊走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。
用傳統的緩衝液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適於環化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴於引物)的上游 或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，並帶有由內切酶和環化類 型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對於擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個鹼基位位的酶，並已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。[1]
用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中，為產生對反向 PCR大小適當的DNA片段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適於連接，環 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內切酶失活。
聚合酶鏈反應條件與經典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環。可改變PCR條件以生產特異產物。將反向 PCR用於測序時，與核心區末端後部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部 分的核心序列與未知邊側序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。
視頻
PCR 衍生技術