檢視基因敲除的原始碼

[[File:基因敲除.jpg|缩略图|[https://pic.sogou.com/d?query=基因敲除&forbidqc=&entityid=&preQuery=&rawQuery=&queryList=&st=&did=15 原图链接][https://www.sohu.com/a/138130941_648430 来自搜狐]]]
'''基因敲除'''（knockout）是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

== 理论来源 ==
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为[[发育生物学]]、[[分子遗传学]]、[[免疫学]]及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。

== 研究历程 ==
基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞(EmbryonicStem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cellmass，ICM)细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠子宫，它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。

基因敲除和基因嵌入技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。<ref>[https://wenwen.sogou.com/z/q801512400.htm 基因删除是什么，和基因敲除有什么分别]搜狗问问</ref>

== 操作步骤 ==
利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：

获得干细胞
基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。由于这些远交系遗传背景复杂，所得到的模式小鼠往往不能得到重复性好的实验结果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。 另一方面，因为回交次数不一样，也会造成实验结果重复性差。这对生物科研，尤其是医药企业，安评中心，药检部门等，是一个很大的缺点。这对开发制作标准模式动物也是一个很大的缺陷。所以，如果能够直接用C57BL/6 ES细胞进行基因打靶，就将直接获得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学，神经学，癌症，等几乎所有研究领域。已经有一些公司或科研机构已经开始用C57BL/6遗传背景的胚胎干细胞进行[[基因打靶]]。

载体构建
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。根据实验目的不同，打靶载体分为全基因敲除，条件性基因敲除，基因敲进，诱导性基因敲除等打靶载体。

导入基因
将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

用选择性培养基筛选已击中的细胞

一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。由于用于TK筛选的Gancyclovir对小鼠的种系传递有影响，一般采用DTA(白喉毒素A亚基）进行阴性筛选。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植入假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

性状改变
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学性状的改变，达到研究目的基因的目的。<ref>[https://mp.weixin.qq.com/s?src=3&timestamp=1613350021&ver=1&signature=VHjngDj-sUGHNbOPAxtDWqo70t7wlL3yqPLXgHs1w8luevgaCCP2YPhGhRnbUl**AXCGszJbOzRShBupCayrDhdvIB54gCty9*iLwTV6aq6Ci9g9brVegmbcojOhA2JX0oUoyZePxkORKps7jk6OZBLbTOdBoE4wITHLRkx1gp4= 基因敲除的原理与方法]微信</ref>

== 技术应用 ==
基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。

近年来，牛、羊、猪、猴等大型哺乳动物实现了基因敲除。但由于狗的生殖生理较为特殊，基因敲除狗的培育难度大为增加，狗基因组的定点修饰一直未获成功。针对这一问题，研究团队设计了一个自体移植的策略，克服了供体胚胎与受体雌犬的生殖周期不同步的难题，大幅提高妊娠率，基因打靶狗得以诞生。

2015年10月，中国科学院广州生物医药与健康研究院联合南京大学南京生物医药研究院、广州医药研究总院等科研单位共同培育的两只基因敲除狗比格犬“大力神”和“天狗”远比同龄小狗显得强壮矫健，它们是世界上首例基因敲除狗。被敲除了肌肉生长抑制素基因后，它们的肌肉生长发育能力增强，4个月时就比普通狗更为肌肉发达，成年后具有更强的运动能力。狗在营养代谢、生理解剖等方面与人类极其相似，是研究人体生理和疾病发生机理的理想实验动物。基因敲除狗的培育将为人类疾病治疗和药物研发提供新的实验动物模型，也将加速培育更多含优良遗传性状的新品系狗。

==参考文献==
{{reflist}}
[[Category:360 生物科學總論]]